伏马毒素B1单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

摘要

伏马毒素（Fumonisins）是由串珠镰刀菌产生的一类双酯型代谢产物，目前已经发现的伏马毒素有28种，其主要成分是伏马毒素B1(FB1)。FB1主要存在于粮食作物和饲料中，具有神经毒性、肝肾毒性和肺毒性等，还可诱发癌症，对人类和动物的健康构成严重的威胁。目前常用于检测FB1的检测方法有多种，包括薄层析色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等，但这些方法都具有需要特殊的仪器，耗时较长，且需要专业人员操作等不足。因此，建立针对FB1快速、简便、灵敏的检测方法具有重要的现实意义。本试验利用单克隆抗体制备及酶联免疫吸附技术，建立了检测FB1含量的ELISA检测方法。该方法具有操作简单，成本低，特异性强等特点，适合大批量样品的快速检测。
　　1.FB1人工抗原的合成与鉴定。根据伏马毒素B1分子结构特点，使用戊二醛一步法将FB1分别与BSA和OVA偶联，合成免疫抗原FB1-BSA与检测抗原FB1-OVA。通过紫外扫描、SDS-PAGE及免疫学方法初步判断FB1与载体蛋白偶联成功。利用BCA法测得FB1-BSA和FB1-OVA的蛋白浓度分别为0.70mg/mL，1.83mg/mL。
　　2.FB1单克隆抗体的制备。将免疫抗原FB1-BSA常规免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠。五免之后一周断尾采血检测抗体效价在1∶10，000以上。加强免疫3d后取免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。利用HAT选择性培养基及酶联免疫吸附技术筛选出阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法进行亚克隆，最后筛选出2株能稳定分泌抗FB1单克隆抗体杂交瘤细胞。5F5和2C6所制腹水效价均达到1∶256，000，腹水蛋白浓度分别为10.79mg/mL和12.21mg/mL。
　　3.ELISA检测方法的建立。选取5F5杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，制备小鼠腹水，建立检测FB1间接竞争ELISA法。利用方阵法确定包被抗原最佳工作浓度为1∶2，000，腹水最佳工作浓度1∶8，000。制备FB1药物抑制标准曲线，线性方程为y=0.1648x+0.3706(R2=0.9845)，半数抑制浓度(IC50)为6.1 ng/mL，LOD低于0.05ng/mL。交叉试验结果显示，制备的单克隆抗体对FB1抑制率100％，与呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZON)等基本无交叉反应。
　　4.回收试验。利用建立的间接竞争ELISA法对饲料玉米进行了FB1添加回收试验。对玉米样品中FB1进行模拟提取，当提取液作8倍以上稀释处理时，基质干扰基本消失，在0.05～500ng/mL范围内标准曲线方程为y=0.1381x+0.4225(R2=0.9822)。在玉米中添加5，50，200，500 ng/mL4个浓度FB1标准品做添加回收率，结果回收率在84.2％～102.6％之间，变异系数在2.48％～8.79％。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．伏马毒素的性质及危害

1．1 伏马毒素概述

1．2 伏马毒素的性质

1．3 伏马毒素的污染现状

1．4 伏马毒素的毒性

2．伏马毒素的检测方法

2．1 伏马毒素的限量标准

2．2 伏马毒素的检测方法

3 研究目的与意义

第二章 FB1完全抗原的制备与鉴定

1．1 材料

1．2 FB1完全抗原的制备

1．3 完全抗原的鉴定

2 结果

2．1 完全抗原浓度的测定

2．2 FB1-BSA紫外分光光度计

2．3 免疫学方法鉴定

2．4 SDS-PAGE完全抗原鉴定结果

3 讨论

3．1 FB1大分子蛋白偶联位点

3．2 FB1完全抗原的合成

3．3 FB1偶联产物的分析

第三章 抗FB1单克隆抗体的制备与ELISA检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 实验动物和细胞

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 小鼠免疫

1．5 BALB／c小鼠免疫效价的测定

1．6 筛选体系的建立

1．7 细胞株的制备及融合

1．8 杂交瘤细胞的筛选，建株及腹水制备

1．9 ELISA方法的建立

2 结果

2．1 BALB／c小鼠免疫效价的测定

2．2 最佳HRP-羊抗鼠抗体及包被抗原FB1-OVA工作浓度的建立

2．3 杂交瘤细胞亚克隆

2．4 腹水制备及其效价测定

2．5 单克隆抗体特异性鉴定

2．6 抗原抗体最佳工作浓度的确定

2．7 CiELISA标准工作曲线绘制

3 讨论

3．1 关于小鼠免疫

3．2 ELISA注意事项

3．3 关于骨髓瘤细胞

3．4 关于细胞融合及杂交瘤细胞的筛选

3．5 关于亚克隆

3．6 单抗的制备及鉴定

第四章 玉米样品的FB1添加回收试验

1 材料和方法

1．1 主要试剂

1．2 仪器与器材

1．3 样品处理

1．4 样品基质干扰

1．5 标准曲线绘制

1．6 回收率测定

2 结果

2．1 样品基质干扰

2．2 样品标准曲线的建立

2．3 添加回收率

3 讨论

结论

参考文献

致谢

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