H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其在抗原变异机制中的研究

摘要

H9N2亚型禽流感病毒自首次分离至今，已在全世界广泛传播，不但给养禽业带来了巨大的损失，而且还严重危害人类健康。为了控制禽流感的传播，禽流感疫苗被广泛的应用。但是由于禽流感病毒的RNA聚合酶缺乏校对机制，造成了禽流感病毒基因组RNA遗传上的不稳定性，变异率极高，而疫苗选择压更是会加速流感病毒的抗原变异，引起免疫失败，甚至引发新的流行。本文中，用A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)禽流感病毒疫苗株（简称F株）免疫小鼠，成功制备五株针对F株的H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，利用这5株单克隆抗体，检测了本实验室前期研究获得的有和无同源疫苗抗体选择压下病毒的抗原变化，发现随着传代代次的增加，病毒的血凝抑制效价显著下降;并且同源疫苗抗体下传代病毒的血凝抑制效价下降得更早，表明同源疫苗抗体加速了流感病毒的抗原变异;进一步研究表明，有一株单克隆抗体可能是针对F株的181位氨基酸所在的抗原表位的单抗。本论文的研究结果将为H9N2亚型禽流感病毒的检测和流行病学调查提供一定的资源。
　　1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备
　　经10日龄SPF鸡胚扩增的F株病毒尿囊液差速离心后获得纯化的F株病毒，将纯化的病毒蛋白作为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠;通过杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过三次间接ELISA筛选融合阳性细胞;随后用有限稀释法对阳性克隆进行三次亚克隆，获得五株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D6、3G8、4A5、6B11和6C12。五株单克隆抗体的腹水效价分别为29、212、27、214、29，腹水的ELISA效价分别为1.0×105、1.6×106、3.2×106、3.2×106、2.0×105。特异性试验显示五株单克隆抗体与H9亚型禽流感病毒发生血凝抑制(HI)反应，与H5亚型禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合症病毒、新城疫病毒无任何交叉反应，证明本论文获得的5株五株单克隆抗体具有良好的特异性;Western blot结果显示五株单克隆抗体在75kd处出现特异的HA条带，表明这五株单克隆抗体均为针对H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的单抗。免疫组织化学检测结果表明，这五株单克隆抗体可以用于免疫组织化学方法检测攻毒鸡气管组织中存在的H9N2亚型禽流感病毒。
　　2、单克隆抗体在抗原变异上的初步应用
　　在前期研究中，本实验室用F株在有和无同源疫苗抗体选择压的SPF鸡胚模型中进行连续传代，收集了第15代、30代、47代、50代和52代病毒。为研究同源疫苗选择压对禽流感病毒抗原变异的作用，本实验首先用5株单克隆抗体比较了有和无同源疫苗抗体选择压下同代次病毒的血凝抑制效价。发现随着传代代次的增加，病毒的血凝抑制效价显著下降;并且有同源疫苗抗体下传代的病毒血凝抑制效价下降得更早，表明同源疫苗抗体加速流感病毒的抗原变异。
　　本实验室前期分析抗原变异的传代病毒的序列发现，其HA基因有4个氨基酸的突变。为探讨HA的氨基酸位点在抗原变异中的作用，本论文通过RT-PCR，基因克隆等分子生物学方法，分别构建了含有K131R、S145N、G181E和A198V四个突变（称为rFHA1）、K131R、G181E和A198V三个突变（称为rFHA2）、以及G181E一个突变的HA(称为rFHA181)，将这三种HA插入pCAGGS哺乳动物载体中，分别称为pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181;然后分别转染到293T细胞中表达HA蛋白;用本论文获得的单克隆抗体经ELISA检测细胞中蛋白的表达水平。结果显示单抗1D6与F株反应良好，但是与pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181三种蛋白都不反应，其余四株单抗与pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181的ELISA效价水平较高。结果表明，单抗1D6的表位可能位于HA的181位，说明HA的181位在抗原的变异中有一定的作用。由于本论文获得的单克隆抗体的株数有限，没有对其余三个突变进行定性，还有待进一步研究。

目录

摘要

符号说明

文献综述

1．流感病毒的概述

1．1 禽流感病毒的病原学

1．2 流感病毒抗原变异与组织亲嗜性和受体特异性的关系

1．3 流感病毒抗原变异与复制能力的关系

1．4 禽流感病毒的监控

2．单克隆抗体的制备及其应用

2．1 利用杂交瘤技术生产单克隆抗体

2．2 利用噬菌体展示技术合成单克隆抗体

2．3 单克隆抗体制备效率的改善措施

2．4 单克隆抗体在流感病毒抗原变异方面的应用

参考文献

第一章 H9N2亚型禽流感病毒血凝素单抗的制备

1．材料

1．1 病毒株

1．2 SPF鸡胚、实验动物、细胞系

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂的配制

1．5 主要设备仪器

2．方法

2．1 疫苗的制备

2．2 动物免疫

2．3 SP2／0骨髓瘤细胞的复苏与准备

2．4 免疫脾细胞的制备

2．5 饲养细胞的制备

2．6 细胞融合

2．7 最适抗原包被浓度的确定

2．8 杂交瘤细胞上清的ELISA检测

2．9 杂交瘤细胞的亚克隆

2．10 杂交瘤细胞的冻存与复苏

2．11 单克隆抗体腹水的制备

2．12 单克隆抗体的检测

2．13 病毒抗原的免疫组织化学检测

3．结果

3．1 制备疫苗的结果

3．2 动物免疫结果

3．3 最适抗原包被浓度的确定结果

3．4 杂交瘤细胞的建株

3．5 单克隆抗体的效价检测结果

3．6 单克隆抗体的Western blot鉴定结果

3．7 单克隆抗体特异性鉴定结果

3．8 病毒抗原的免疫组织化学检测结果

4．讨论

5．结论

参考文献

第二章 单克隆抗体在抗原变异机制研究中的应用

1．材料

1．1 病毒株

1．2 细胞系

1．3 质粒和基因

1．4 主要试剂

1．5 主要试剂的配制

1．6 主要设备仪器及耗材

2．方法

2．1 五株单克隆抗体对不同病毒HI效价的检测

2．2 单克隆抗体所针对位点的初步筛选

3．结果

3．1 五株单克隆抗体对不同传代病毒病毒HI效价的检测结果

3．2 含HA突变的真核表达载体的构建结果

3．3 单克隆抗体所针对位点的初步筛选结果

4．讨论

5．结论

参考文献

全文小结

致谢

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