不同鸡MHC单倍型的判定及同种异型抗血清的制备

摘要

我国是养禽大国且养禽产业发展非常迅速，而疾病是限制养殖业发展的一个重要因素。长时间以来，养禽业控制疾病主要依赖疫苗免疫，由于MDV等病毒的普遍存在及病毒毒力的不断增强等许多原因，使得免疫鸡群甚至是免疫过疫苗的鸡群仍时有感染。因此，研究者开始转向鸡的抗病育种研究，期望能在遗传素质上提高鸡只的抗病性。许多研究已经表明，MHC基因的多态性在家禽中与多种传染病的抗性存在高度相关性，是家禽抗病育种研究中的优选标记基因。在鸡上，已发现某些MHC单倍型与抗病性、免疫应答及经济性状间具有相关性，但对其研究还远远落后于人类，分析出不同鸡种的血型单倍型关系并对那些具有抗性的鸡种进行选育，具有重要的经济意义。本研究以26个中国地方鸡种和外来鸡种为研究对象，根据MHC基因上LEI0258微卫星座位的序列信息，对这些鸡种进行MHC单倍型的判定，并在新扬州鸡群体内制备了B21和B18两种同种免疫抗血清，并在不同鸡群中用血清学方法对抗血清进行了验证。
　　首先，为了确定不同鸡种的MHC单倍型，我们选取26个鸡种，每个鸡种按照10个个体混成一个DNA池的标准送入华大基因公司(BGI)对MHC基因进行目标捕获测序，找出不同鸡种MHC基因序列上的差异，发现在BLB2、BMA2、B-NKNK、LOC100858749、TAP2基因上外来鸡种与地方鸡种存在较大差异，这些基因可以作为以后抗病研究的候选基因。根据MHC基因上LEI0258微卫星重复序列片段数目的不同以及围绕重复序列的侧翼序列的多态性，对不同鸡种进行MHC单倍型的判定，并根据文献资料，对不同血型单倍型与疾病抗性的关系进行统计分析。结果表明:LEI0258微卫星座位序列多态性丰富，不同鸡种在LEI0258微卫星座位上也存在着位点差异性，26个鸡种分为以下不同单倍型:乌骨鸡为B18单倍型;来航鸡为B5单倍型;溧阳鸡为B10/B24/B26/B76单倍型;广西黄鸡与白耳鸡为B72/B78单倍型;罗斯鸡、固始鸡、雪山草鸡、萧山鸡、隐性白羽鸡、鹿苑鸡、太湖鸡和绿壳蛋鸡都为B21.1/BQ/BW1单倍型;安卡鸡、大骨鸡、文昌鸡及青脚麻鸡为BC单倍型;斗鸡、红色原鸡、仙居鸡、狼山鸡、如草鸡、北京油鸡和AA鸡为BC/B21.1/BQ/BW1单倍型;藏鸡与茶花鸡出现了新的单倍型。由于MHC血型单倍型与疾病抗性存在密切关系，根据文献报道及测得不同鸡种的MHC单倍型，结果显示:乌骨鸡为B18单倍型对SE显示为易感性;来航鸡为B5单倍型对MD、RSV、ALV以及IBD显示出易感性;罗斯鸡、固始鸡、雪山草鸡、萧山鸡、隐性白羽鸡、鹿苑鸡、太湖鸡、绿壳蛋、斗鸡、红色原鸡、仙居鸡、狼山鸡、如草鸡、北京油鸡和AA鸡都含B21单倍型，对MD、AL以及IBD显示出较强的抗性，这些鸡种对不同疾病显示出不同的抗性。这些结果表明我国地方鸡种中MHC单倍型种类比较丰富，遗传多样性较高，这可能是地方鸡种比外来鸡种及现代商业品种抗性强的主要原因之一。
　　由于血型是可以遗传的，通过红细胞凝集实验利用特异性抗血清可以快速鉴定出不同鸡种的血型，这种方法简便快捷，有广泛的使用价值。我们选定新扬州鸡对LEI0258微卫星片段进行扩增并进行重测序分析，找出含有B21和B18单倍型的鸡只，并以它们的外周血红细胞作为免疫原，对其它单倍型鸡进行免疫，制备了同种异型抗血清，建立了微量血凝试验，对抗血清效价进行了测定并在新扬州鸡和罗斯鸡群体内用血清学方法进行了验证。结果表明:新扬州鸡群体内存在不同单倍型，同单倍型不同个体鸡的效价大致相同，B21抗血清血和B18抗血清凝效价均为1∶4。利用血清学鉴定手段在新扬州鸡和罗斯鸡群体内检测两种抗血清效果，结果显示新扬州鸡群体内B21单倍型个体比例较高，罗斯鸡群体内B18单倍型个体比例较高，此结果也进一步说明中国地方鸡种抗性优于商业品种。利用克隆测序对选取的新扬州鸡和罗斯鸡进行验证，序列信息结果与血凝结果呈现一致性。本研究结果为鸡的血型鉴定提供了物质基础，也为抗病育种研究提供基础材料。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．家禽抗病育种研究进展

1．1 家禽抗病育种意义

1．2 家禽抗病育种的遗传基础

1．3 家禽抗病育种的方法

1．4 家禽抗病育种现状及展望

2．主要组织相容性复合体(MHC)的研究进展

2．1 MHC的命名

2．2 鸡的MHC结构

2．3 鸡MHC的功能研究

2．4．鸡MHC与抗病性的相关性研究

2．5 鸡MHC研究展望

3．家禽血型研究进展

3．1 血型的基本概念

3．2 鸡血型研究的应用

3．3 鸡血型系统的判定

4 抗血清的制备

4．1 抗血清的概念

4．2 抗血清的制备步骤

4．3 免疫抗血清的应用

5 测序技术的发展与应用

5．1 测序技术的发展

5．2 测序技术的应用

6．本研究的目的和意义

第二章 利用微卫星序列多态性对不同鸡种进行MHC单倍型判定

1 引言

2．实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要仪器

2．3 主要试剂

3．实验方法

3．1 利用目标捕获测序技术对不同鸡种进行测序

3．2 不同鸡种MHC基因及LEI0258微卫星座位序列信息分析

4．结果与分析

4．1 不同鸡种MHC基因序列分析

4．2 LEI0258微卫星座位结构特征

4．3 不同鸡种的LEI0258微卫星座位分析

4．4 不同鸡种MHC单倍型的判定

4．5 不同鸡种单倍型与疾病抗性的关系分析

5．讨论

第三章 两种重要的同种异型抗血清的制备

1．引言

2．实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要实验仪器

2．3 主要试剂

3．实验方法

3．1 判定选取鸡种的单倍型

3．2 同种异型抗血清的制备

4 结果与分析

4．1 新扬州鸡群体内不同鸡只的血型单倍型

4．2 抗血清血凝效价的测定

4．3 特异性抗血清的应用

4．4 测序验证抗血清效应

5．讨论

全文结论

参考文献

致谢

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