氯化钴对Walker256细胞HSP90的表达及其抑制剂17-AAG对细胞凋亡和生长影响

摘要

目的：
　　观察氯化钻(CoCl2)在体外模拟低氧对肝癌Walker256细胞形态的改变及增殖能力的影响，进一步确立合适的肝癌Walker256细胞的体外缺氧模型。并在该缺氧模型基础上观察不同程度缺氧对肝癌Walker256细胞中HSP90蛋白的表达能力的影响，并探讨可能的影响机制。
　　方法：
　　1.倒置显微镜法观察不同浓度的CoCl2(0、50、100、200、300、500μmol/L)和不同浓度的17-AAG(0、0.1、0.25、0.5、1、2μmol/L)分别处理肝癌Walker256细胞48h后，观察其细胞形态的改变。
　　2.MTT法测定不同浓度COCl2（0、50、100、200、300、500μmol/L）和不同浓度的17-AAG抑制剂(0、0.1、0.25、0.5、1、2μmol/L)分别经不同的时间段处理肝癌Walker256细胞，来检测其增殖能力的影响。
　　3.蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别检测不同浓度的CoCl2(0、50、100、200、300、500μmol/L)和0.5μmol/L17-AAG作用于Walker256细胞后，对细胞中HSP90及Bcl-2表达的影响。
　　4.Annexin-FITC/PI流式细胞双染技术检测17-AAG对肝癌Walker256细胞的凋亡的影响。
　　5.用Walker256细胞的细胞悬液建立大鼠种植瘤模型，并将成瘤实验大鼠分为经腹腔给予17-AAG和不给予17-AAG两组（各组15只大鼠），观测比较两组大鼠种植瘤的平均体积。
　　结果：
　　1.不同浓度的CoCl2对细胞具有一定程度的增殖抑制作用。300μmol/L和500μmol/LCoCl2作用于细胞，镜下观察可见大量细胞碎片，细胞膜出现明显的皱缩。Western Blot结果显示CoCl2处理细胞48h后，能够上调HSP90的表达，该作用具有浓度依赖性。
　　2.不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG对Walker256细胞的增殖抑制作用具有时间和剂量的依赖性。17-AAG对细胞形态也有影响，对照组Walker256细胞饱满呈圆形，胞质丰富，大小均一，包膜完整，而经17-AAG作用48 h后的Walker256细胞则明显减少，细胞边缘模糊、形态差，部分细胞包膜破裂。Annexin-FITC/PI染色法检测分析结果显示:①与常氧组相比低氧组细胞凋亡比率无明显差异(P＞0.05）;②与常氧组相比较17-AAG+常氧组细胞凋亡比率增加（P＜0.05）;③与低氧组相比17-AAG+低氧组细胞凋亡比率增加(P＜0.05);④与17-AAG+低氧组相比17-AAG+常氧组细胞凋亡比率增加(P＜0.05)。
　　同时通过Wester Blot检测分析结果显示:①与常氧组相比，低氧组的HSP90和Bcl-2表达增强(P＜0.05）;②与常氧组相比，17-AAG+常氧组的HSP90和Bcl-2表达受到抑制(P＜0.05);③与低氧组相比，17-AAG+低氧组的HSP90和Bcl-2表达也受到抑制(P＜0.05）;④17-AAG+低氧组与17-AAG+常氧组相比，HSP90和Bcl-2的表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　3.17-AAG抑制剂能够明显抑制大鼠种植瘤的生长，随着给药时间的延长，发现给药组大鼠种植瘤生长较对照组明显缓慢，对照组大鼠种瘤平均体积始终呈增长的趋势。
　　结论：
　　1.不同浓度的CoCl2能诱导HSP90的表达，当CoCl2在200μmol/L的剂量时诱导作用最为明显。
　　2.HSP90抑制剂17-AAG能够明显抑制大鼠种植瘤的生长。
　　3.HSP90抑制剂17-AAG能够明显的促进细胞凋亡的发生，因而推测其机制可能是17-AAG与HSP90结合后，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，从而使肿瘤凋亡明显增加。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

1．材料试剂与主要的仪器设备

1．1 实验材料与仪器

1．2 主要的试剂与抗体

1．3 主要的实验仪器

1．4 试剂的配制

2．细胞的处理

2．1 细胞的复苏

2．2 细胞的换液与传代

2．3 细胞的冻存

3．MTT法测定细胞增殖能力的影响

3．1 实验分组

3．2 实验步骤

3．3 倒置显微镜观察细胞形态

4．Western Blot检测分析

4．1 细胞总蛋白的提取

4．2 细胞总蛋白含量的测定(BCA法)

4．3 灌胶与上样

4．4 电泳

4．5 转膜

4．6 免疫反应

4．7 显影、定影

4．8 凝胶图像分析

5．细胞凋亡观察与检测

6．大鼠种植瘤模型的建立

7．统计学分析

结果

1．氯化钴对细胞形态学的影响

2．氯化钴对细胞增殖能力的变化

3．低氧环境下CoCl2诱导HSP90的表达

4．HSP90抑制剂17-AAG对细胞的增殖抑制作用

5．17-AAG对Walker256细胞形态的影响

6．低氧环境下17-AAG对Walker256细胞凋亡的影响

7．17-AAG对Walker256细胞HSP90和Bcl-2蛋白表达的影响

8．大鼠种植瘤模型的建立

9．给予17-AAG后对照组和给药组大鼠肿瘤的生长情况

讨论

1．HSP90基因结构与功能

2．HSP90在肿瘤中的作用

3．低氧可诱导HSP90的表达

4．HSP90抑制剂17-AAG的作用及干预实验

结论

参考文献

综述：热休克蛋白90与恶性肿瘤的研究进展

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢

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