基于miR-29b调节SP1/IL-10对D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证的分子生物学研究

摘要

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适为主，伴有大便性状改变的功能性胃肠病，全球总患病率为5％-30％，国内IBS就诊率占消化内科门诊病人总数的34.3％，临床上以腹泻型肠易激综合征(Diarrhea-predominant irritable bowelsyndrome，D-IBS)较多见。D-IBS属中医“腹泻”、“腹痛”等范畴，脾主运化，肝主疏泄，当脾胃的运化、肝的疏泄功能和升清降浊功能、大肠的传导功能及肾的温煦功能失调，均可能导致D-IBS的发生。本病的发病常由于饮食不节、情志失调诱发，肝郁脾虚为主要发病机制。由于D-IBS发病机制的多因素性、复杂性，导致其难以治愈、症状长期存在或反复发作，患者频繁就医，严重影响患者生活质量和心身健康。有研究发现IBS患者，糖尿病前期发生率要明显高于健康人群，究竟在D-IBS患者中2型糖尿病的发病情况如何，D-IBS合并2型糖尿病患者中医证型、精神心理状况及生活质量等均未见报道。
　　microRNA(miRNA)是一类长约21-23nt的内源性单链非编码小RNA，可通过与靶基因完全或不完全互补，在转录后水平对编码蛋白的基因表达起负调控作用。部分研究学者认为miRNA在IBS的发生发展中异常表达，但真正确认功能的miRNA只有一部分。目前关于D-IBS合并2型糖尿病miRNA表达谱的研究鲜有报道，差异表达的miRNAs在D-IBS合并2型糖尿病发生发展的生物学过程中究竟发挥怎样的作用尚未完全清楚。
　　本研究首先对D-IBS患者与同期体检者的2型糖尿病发病情况进行临床调查，并对D-IBS合并2型糖尿病患者和单纯D-IBS患者进行问卷调查，问卷内容包括:一般人口学特征、中医证型、精神心理状况及生活质量量表(IBS-quality of life measure，IBS-QOL);其次，对D-IBS合并2型糖尿病患者、单纯D-IBS患者、2型糖尿病患者及对照组进行血浆miRNA表达谱进行研究，筛选D-IBS合并2型糖尿病差异表达的特异miRNA，qRT-PCR验证差异表达的miRNAs，生物信息学分析可能的发病机制;最后建立D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证大鼠模型，探讨miR-29b在D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证模型大鼠中的作用机制及生物学功能，为该病的中西医结合临床诊断及治疗奠定理论基础。本研究内容共分四部分:
　　第一部分 D-IBS合并2型糖尿病患者中医病证及生活质量研究
　　目的:了解我国D-IBS患者糖尿病的发病情况及D-IBS合并2型糖尿病患者一般人口学特征、中医证型、精神心理状况及生活质量。
　　方法:收集2013年5月至2015年5月扬州大学临床附属医院江苏省苏北人民医院消化门诊就诊的D-IBS患者388例，研究对象均符合罗马Ⅲ诊断标准，并且排除与症状相关的器质性疾病;对照组为上述相应的医疗单位健康体检者220人;两组均进行血糖测定。对入组患者进行临床问卷调查，问卷内容包括:一般人口学特征、中医证型、精神心理状况及生活质量。
　　结果:1、D-IBS组2型糖尿病发病率为46.4％，与同期体检者(15.5％)相比差异显著(p＜0.05)，且2型糖尿病发病与D-IBS病程长短有关，D-IBS病程越长，合并2型糖尿病风险越高;2、180例D-IBS合并2型糖尿病患者中，肝郁脾虚证134例，占74.4％，脾肾阳虚证22例，占12.2％，脾虚湿困证17例，占9.5％，脾胃湿热证7例，占3.9％;3、D-IBS合并2型糖尿病患者存在更严重的消化道症状;4、D-IBS合并2型糖尿病患者存在更严重的焦虑及抑郁;5、D-IBS合并2型糖尿病患者在烦躁不安、健康忧虑、冲突行为及饮食限制四个维度方面的生活质量明显下降。
　　结论:D-IBS患者2型糖尿病的发病率明显高于健康体检者，提示D-IBS可能是2型糖尿病的高风险因素之一;D-IBS合并2型糖尿病患者以肝郁脾虚证为主型，且这部分患者的胃肠道症状、精神心理状态及生活质量明显低于D-IBS。
　　第二部分 D-IBS合并2型糖尿病血浆miRNA表达谱及miR-29b差异表达的研究
　　目的:研究D-IBS合并2型糖尿病血浆miRNA表达谱，筛选差异表达的miRNAs，并对差异表达miRNA靶基因进行生物信息学分析。
　　方法:随机选取D-IBS合并2型糖尿病、D-IBS、2型糖尿病、健康对照组各3例血浆标本，采用miRNA寡核苷酸芯片进行检验分析，筛选出差异表达的miRNA;采用GO(Gene ontology)分析及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析对差异表达的miRNA靶基因进行生物进程、细胞组分、分子功能、信号通路分析;根据芯片结果及文献，筛选出代表性的差异表达miRNA，采用定量反转录聚合酶链反应(Quantificationalreal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技术在大样本血浆中进一步验证，根据验证结果对miRNA进行受试者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)分析。
　　结果:1、D-IBS合并2型糖尿病组差异表达的miRNA有35个，其中上调表达的miRNA有6个，下调表达的miRNA有29个;2、生物信息学分析结果显示，差异表达miRNA的靶基因与细胞核内DNA依赖的转录调节水平及蛋白绑定关系最为密切;3、D-IBS合并2型糖尿病患者血浆中miR-106b、miR-29b、miR-26a存在不同程度的表达上调，与miRNA芯片筛选结果一致。ROC分析结果显示miR-29b ROC曲线下面积（Area under roccurve，AUC)＞0.9，说明其作为D-IBS合并2型糖尿病诊断标志物有较高的准确性。
　　结论:通过基因芯片筛查D-IBS合并2型糖尿病患者血浆中存在35个差异表达的miRNA，且miR-29b呈特异性高表达，研究结果有望为D-IBS合并2型糖尿病的诊断提供一种新的非侵入性的分子诊断方法。生物信息学分析提示差异表达的miRNAs的靶基因与细胞核内DNA依赖的转录调节水平及蛋白绑定关系最为密切。
　　第三部分 D-IBS合并2型糖尿病大鼠肝郁脾虚证模型的建立与评价
　　目的:探索D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证大鼠模型的建立方法。
　　方法:4周龄SPF级Wistar大鼠适应性饲养一周后，随机分为普通饮食组和高脂饮食组。高脂饮食组喂养4周后，小剂量(35mg/kg)多次腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)溶液，随机血糖超过11.1 mmol/L的大鼠视为2型糖尿病模型成功制备。2型糖尿病模型成功建立后，随机选取10只建立D-IBS肝郁脾虚证模型，同时普通饮食组随机选取10只建立D-IBS肝郁脾虚证模型。造模前禁食不禁水12h，予以生大黄溶液(1 g/mL)灌胃，2mL/只，每日两次。在灌服生大黄溶液1h后用宽透明胶带束缚大鼠的肩部、前肢及胸部，限制大鼠用前肢搔抓头面部，但不限制其活动，束缚时间为1h。造模持续4周。造模结束后，观察各组大鼠一般情况、腹泻情况、口-肛传输时间、内脏敏感性检测、旷场实验及近端结肠病理组织学变化。
　　结果:1、一般情况:D-IBS合并2型糖尿病组饮水量、摄食量、尿量明显增多，体重明显减轻;2、D-IBS合并2型糖尿病组大便积分明显变大，含水量明显增多，稀便级明显增加;3、D-IBS合并2型糖尿病组口-肛传输时间明显减少，内脏敏感性明显增加，旷场实验中总路程、平均速度及进入中央区活动的时间明显降低;4、各组大鼠结肠组织形态结构未见明显器质性改变，除对照组外，D-IBS合并2型糖尿病组、D-IBS组、糖尿病组结肠组织粘膜轻度水肿，偶见上皮细胞排列不整，局部少量炎性细胞浸润。
　　结论:高脂饮食+链脲佐菌素+慢性束缚+大黄煎煮液灌胃是复制D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证动物模型较为合理的造模方法;基于血糖、大便特征、肠道敏感性和病理组织学改变是判定D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证动物模型是否成功的重要依据。
　　第四部分基于miR-29b调节SP1/IL-10对D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证的分子生物学研究
　　目的:研究miR-29b是否通过靶定SP1基因降低IL-10表达参与D-IBS合并2型糖尿病发病机制。
　　方法:采用qRT-PCR方法验证模型组大鼠血浆中miR-29b表达情况;构建MSCV-PIG-miR-29b质粒、PGL3-SP13'UTR质粒和PGL3-SP13'UTR(mut)质粒，通过双荧光报告基因和过表达miR-29b验证miR-29b对其靶基因SP1的直接调控作用;qRT-PCR方法、Western-Blot及免疫组织化学的方法检测不同动物模型结肠组织中SP1 mRNA和SPI蛋白的表达情况，ELASA方法检测血浆中IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α的表达。
　　结果:1、D-IBS合并2型糖尿病模型组大鼠血浆中miR-29b表达量明显增多，与对照组相比差异显著(p＜0.05);2、双荧光素酶报告实验显示miR-29b能够通过作用于SP13'UTR区的特定位点对其进行负调节;3、D-IBS合并2型糖尿病模型组结肠组织中SP1 mRNA和SP1蛋白表达量明显降低;4、与其他三组相比，D-IBS合并2型糖尿病组IL-10表达明显下降。
　　结论:miR-29b可能是通过靶定SP1基因降低IL-10表达参与D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证发病机制。
　　综上所述:D-IBS组2型糖尿病发病率明显高于健康体检者，且D-IBS合并2型糖尿病患者以肝郁脾虚证为主型，患者伴有心理异常，生活质量明显下降;miRNA芯片筛查发现D-IBS合并2型糖尿病患者血浆中存在35个差异表达miRNA，miR-29b呈特异性高表达，生物信息学分析提示差异miRNAs的靶基因与细胞核内DNA依赖的转录调节水平及蛋白绑定关系最为密切;通过高脂饮食+链脲佐菌素+慢性束缚+大黄煎煮液灌胃是复制D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证动物模型较为合理的造模方法;SP1是miR-29b直接靶基因之一，D-IBS合并2型糖尿病模型组大鼠血浆中miR-29b明显增高，肠组织中SP1mRNA及SP1蛋白表达水平明显下降，IL-10表达水平明显降低。
　　本研究认为miR-29b可能是通过靶定SP1基因降低IL-10表达参与D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证发病机制，该结果可为D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证的中西医结合诊断和治疗提供一定的理论依据。

目录

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 D-IBS合并2型糖尿病中医病证及患者生活质量研究

1 对象与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 D-IBS合并2型糖尿病的miRNA表达谱及miR-29b的差异表达研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 D-IBS合并2型糖尿病大鼠肝郁脾虚型模型的建立与评价

1 实验材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 miR-29b对D-IBS合并2型糖尿病肝郁脾虚证SP1／IL-10信号通路调控机制的初步研究

1 实验材料及方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

综述 microRNA在肠易激综合征发生发展中的研究进展

附录

致谢

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