TRPV5在维生素D调控破骨细胞分化和骨吸收中的作用

摘要

骨骼是一种不断更新的动态器官。破骨细胞(osteoclast，OC)和成骨细胞(osteoblast，OB)是分别负责骨吸收和骨重建的功能细胞，骨更新动态平衡的破坏会引起一系列的骨代谢异常性疾病，如骨质疏松、骨硬化症等。维生素D是一种类固醇类激素，1α，25-(OH)2D3是维生素D在体内的最强活化形式，参与骨代谢的调节，在维持机体内钙离子稳态中有着重要作用。TRPV5是一种发现于肾小管的，对Ca2+具有高敏感性的通道蛋白。研究发现，缺少TRPV5通道，将影响OC的分化及骨吸收功能，但对于其作用机制目前还不清楚。本文研究了TRPV5在小鼠单核细胞分化为OC过程中的作用和机制，以及在维生素D调控OC分化过程中的作用。为进一步阐明OC相关的骨吸收活动调节机制提供理论依据，研究内容如下:
　　1.细胞接种密度对维生素D调控OC分化的影响
　　为了研究单核细胞不同接种密度对OC分化能力的影响，从4至5周龄BALB/c小鼠骨髓腔分离得到骨髓单核细胞，以0.3、0.7、1.5、3、6、12、24、48×104/孔(0.94、2.18、4.68、9.37、18.75、37.5、75、150×104/cm2)的密度接种于96孔板。用含50 nmol/LM-CSF和30 nmol/L RANKL的α-MEM培养液培养3d，更换培养液为含30 nmol/L M-CSF、50 nmol/L RANKL及10 nmol/L1，25(OH)2D3的α-MEM，培养2d后TRAP染色鉴定OC，免疫荧光检测OC中VDR表达水平。结果显示，随着单核细胞接种密度的升高，OC生成数量增加，呈上升趋势;但OC的生成率与细胞接种密度呈负相关，接种浓度越高，则OC的生成率越低，呈下降趋势。VDR在单核细胞、未成熟的OC以及成熟OC中均有分布。不同接种密度的单核细胞，维生素D对其分化为OC的影响不同。当细胞接种密度为18.75、37.75、75×104/cm2时，与空白组相比维生素D可以显著抑制OC的生成;而接种浓度为0.93、2.18×104/cm2时，维生素D可以显著促进OC的生成。
　　2.TRPV5在OC分化及骨吸收中的作用
　　为了探讨TRPV5在OC分化及骨吸收过程中的作用，本实验采用RuR作为TRPV5通道阻滞剂，研究不同浓度RuR(0、10、50、100、500、1000 nmol/L)对OC分化以及活性的影响。同时，RuR在不同浓度和时间下(1、2、3d)作用OC，western-blot检测OC中TRPV5以及骨吸收活性相关蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、CaⅡ表达水平。结果表明，0、10、50、100、500以及1000 nmol/L RuR对OC活性没有显著影响，但是各浓度的RuR均显著抑制OC的分化能力。不同浓度(10、100、1000nmol/L) RuR在不同时间(1、2、3d)均显著抑制TRPV5的表达，同时骨吸收活性相关蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP以及CaⅡ的表达量也出现一定程度下降，并且NFAT1的表达水平呈现一定程度的抑制。
　　3.TRPV5在维生素D调控OC中的作用
　　为了研究TRPV5在维生素D调控OC分化及骨吸收过程中的作用，在不同浓度、时间下通过维生素D作用OC，检测维生素D对TRPV5表达水平的影响。在第3、5、7d添加维生素D、维生素D+TRPV5阻滞剂(RuR/ECO)、TRPV5阻滞剂(RuR/ECO加处理，每次处理时间为2d，于第9 d TRAP染色并计数OC。同时，利用western-blot检测骨吸收标志蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、CaⅡ以及OC转录因子NFATc1在该条件下的表达水平。结果显示，维生素D仅在处理1d和2d时抑制TRPV5的表达水平。也仅在2d时维生素D显著抑制OC分化，同时，添加维生素D+TRPV5阻滞剂可持续抑制OC的分化，但维生素D组与维生素D+TRPV5阻滞剂组OC分化水平并没有显著差异性。维生素D+TRPV5阻滞剂组与维生素D组相比显著抑制了骨吸收标志蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、CaⅡ的表达，但是对NFATc1的表达水平并没有显著影响。结果表明，维生素D通过降低TRPV5在OC前体细胞中的表达，从而抑制RANKL通过TRPV5激发NFATc1，抑制前体细胞向OC的分化。

目录

摘要

缩略语表

第一部分 文献综述

第一章 OC分化过程中相关机制的研究进展

1．M-CSF／c-Fms通路与OC分化的调控

2．RANKL／RANK与OC分化的调控

第二章 TRPV5在OC中的研究进展

1．TRPV5的生理特性

2．TRPV5与OC的分化及骨吸收

第三章 维生素D调控OC相关机制的研究进展

1．维生素D简介及基本生理功能

2．维生素D调控OC的作用机制

3．维生素D和TRPV5在肾脏维持钙稳态中的作用及对OC相关功能的启示

第二部分 试验研究

第一章 细胞接种密度对维生素D调控OC分化的影响

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第二章 TRPV5在OC分化及骨吸收中的作用

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第三章 TRPV5在维生素D调控OC中的作用

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

参考文献

全文结论

致谢

攻读学位期间发表论文

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