AT14A在拟南芥响应PEG模拟干旱胁迫中的功能分析

摘要

干旱是影响作物生长发育，限制产量的重要环境胁迫因子之一。阐明植物对干旱胁迫的响应机理是植物抗性机制研究中重要的途径之一。当植物受到干旱胁迫时，植物细胞感知干旱信号，以启动细胞信号转导，从而得以生存。干旱胁迫可以影响植物细胞质膜和细胞壁之间的相互作用。细胞壁和/或细胞壁—细胞膜的相互作用部位是感知干旱胁迫的重要部位。已有的研究表明，植物细胞中存在细胞壁-质膜-细胞骨架连续体，其在植物响应干旱胁迫过程中具有重要调控作用。
　　AT14A介导了细胞壁-质膜-细胞骨架连续体，它是连续体的中间组分，具有调节细胞壁和细胞骨架组织的重要作用。通过拟南芥A T14A的序列分析，发现其与动物整合素存在序列相似性，因此推断AT14A可能为一种类整合素蛋白。为了深入研究AT14A的功能，尤其在拟南芥响应干旱胁迫中的作用机理，本论文以AT14A相关基因型（野生、缺失、过表达）拟南芥悬浮细胞和植株为实验材料，用PEG-6000模拟干旱胁迫处理，综合利用基因表达分析、生理生化分析、转录组学、定量蛋白组学和生物信息学等多种生物学方法分析AT14A的功能。
　　主要结果如下:
　　1.RT-PCR试验结果表明PEG模拟干旱胁迫能诱导悬浮细胞AT14A的表达。相对于野生型悬浮细胞，AT14A过表达(AT14A-OE)悬浮细胞具有更高的生物量积累和存活率，因此它更能适应干旱胁迫。而且，A T14A-OE悬浮细胞具有较低的过氧化氢积累、膜脂过氧化程度和电解质渗漏;较高的可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性（如POD和APX），因此它表现出更好的防护氧化损伤能力。总之，这些研究结果表明，AT14A在拟南芥悬浮细胞响应PEG模拟干旱胁迫中具有重要的调控作用。AT14A的过表达提高了细胞对干旱胁迫的适应性。它通过调控抗氧化防护系统应答，抑制ROS产生、膜脂过氧化和离子渗透水平来缓解干旱胁迫诱导的氧化损伤。
　　2.AT14A在拟南芥植株根、茎、叶和花中均有表达，尤其叶片中的表达较高。PEG模拟干旱胁迫能诱导叶片A T14A的表达。与野生型(WT)植株相比，缺失突变体（at14a）植株对土壤干旱更敏感。通过转录组学的方法，分析两基因型（WT和at14a）植株响应干旱胁迫后的差异基因。野生型植株的叶片差异基因中681个表达上调，613个表达下调;缺失突变体植株的叶片差异基因中1018个表达上调，1413个表达下调。定量PCR验证结果显示，两基因型植株ABA合成相关基因(AAO3，NCED5)和依赖于ABA的干旱相关基因(RAB18，RD22)的表达量均升高了，但相比较于野生型(WT)植株，缺失突变体（at14a）植株中，AAO3，NCED5，RAB18，RD22的表达均较低。随着干旱时间的延长，两基因型（WT和at14a）植株叶片ABA的含量均升高，复水后ABA含量均下降，但相比较于野生型(WT)植株，缺失突变体（at14a）植株ABA含量均较低。这些研究结果表明AT14A在干旱胁迫诱导ABA合成中发挥重要作用。它通过调控ABA合成关键基因(AAO3,NCED5)的表达，从而调控ABA的合成，最终调控干旱胁迫诱导ABA的合成过程。同时，AT14A也通过调控依赖于ABA途径的干旱相关基因(RAB18，RD22)的表达来适应胁迫。
　　3.通过定量蛋白组学的方法，分析两基因型（WT和at14a）植株响应干旱胁迫后的差异蛋白。干旱胁迫前，两基因型植株的差异蛋白共123个，表达上调的71个，表达下调52个;干旱处理后，两基因型植株的差异蛋白共625个，表达上调的339个，表达下调286个。干旱胁迫后，两基因型植株的抗氧化防护酶APX1和V-H+ATPase E1的表达均升高，但相比较于野生型(WT)植株，缺失突变体（at14a）植株中这些分子的表达量更低。这些研究结果进一步验证了AT14A参与细胞防护氧化损伤。这些结果也表明AT14A通过调控V-H+ATPase E1的表达来响应干旱胁迫。
　　总之，AT14A在拟南芥应答干旱胁迫中有重要作用。这些结果不仅有利于我们对AT14A蛋白在干旱胁迫的感知和信号转导调控机理方面的理解，而且对利用现代生物技术提高植物的抗旱性具有重要的指导意义。

目录

摘要

符号说明

第1章 文献综述

1．1 干旱胁迫与脱落酸

1．2 干旱胁迫与抗氧化系统

1．3 转录组学和蛋白组学在植物耐旱机理研究中的应用

1．3．1 转录组学在植物耐旱机理研究中的应用

1．3．2 蛋白组学在植物耐旱机理研究中的应用

1．4 植物类整合素

1．5 AT14A蛋白

1．5．1 AT14A的结构分析

1．5．2 AT14A蛋白的亚细胞定位

1．5．3 AT14A蛋白的生理功能

1．6 研究目的和意义

第2章 AT14A介导了PEG模拟干旱胁迫诱导细胞抗氧化过程

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 植物材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 实验仪器

2．2．4 实验处理

2．2．5 试验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 PEG模拟干旱胁迫诱导AT14A的表达

2．3．2 转基因悬浮细胞AT14A-OE的表达分析

2．3．3 转基因悬浮细胞AT14A-OE的表型分析

2．3．4 AT14A介导了PEG模拟干旱诱导的氧化损伤

2．4 小结与讨论

第3章 AT14A调控拟南芥响应干旱胁迫的转录组学分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 试验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 AT14A的组织表达特性

3．3．2 干旱胁迫诱导叶片AT14A表达

3．3．3 不同基因型植株抗旱表型分析

3．3．4 不同基因型拟南芥转录组学分析

3．4 小结与讨论

3．4．1 讨论

3．4．2 结论

第4章 AT14A调控拟南芥响应干旱胁迫的蛋白组学分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 试验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 不同基因型拟南芥蛋白组学分析

4．3．2 干旱胁迫对两基因型拟南芥叶片蛋白质表达的影响

4．4 小结与讨论

4．4．1 讨论

4．4．2 结论

第5章 总结和展望

5．1 小结

5．2 展望

参考文献

附录

发表的学术论文目录

致谢

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