拟南芥AT14A蛋白介导细胞壁合成及其在响应干旱胁迫中的功能

摘要

AT14A蛋白是拟南芥中一个功能未知的蛋白，其氨基酸序列中有一段与动物整合素蛋白相似的保守序列。作为跨膜受体蛋白超家族之一，整合素是动物细胞质膜上胞外基质-质膜-细胞骨架连续体(ECM-PM-CTK continuum)的中间成员，参与了信号的双向转导过程。胞外基质-质膜-细胞骨架连续体是所有真核细胞所共有的一种结构。植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的研究还处于起步阶段，特别是质膜上的联结分子还未形成定论，而该联结分子和连续体参与了植物包括干旱胁迫响应在内的多个反应过程，具有重要的研究意义。目前还不清楚AT14A蛋白是否就是植物细胞中的整合素蛋白(又称为类整合素，integrin-like protein)。并且，胞外基质-质膜-细胞骨架连续体在响应干旱胁迫过程中所起的作用也不清楚。本研究以拟南芥为试验材料，综合利用分子生物学、植物生理学、生物化学和细胞生物学等技术，研究了AT14A蛋白的功能，特别是AT14A蛋白对细胞壁及其组分间的影响及其在响应干旱胁迫的功能研究。主要结果如下： 1、采用RT-PCR和TOPO克隆的方法从野生型拟南芥中克隆出了AT14A基因，并与报告基因GFP融合构建表达载体，再将其转入农杆菌，并通过农杆菌介导的方法转化拟南芥植株和悬浮细胞，获得了相应的转基因植株和悬浮细胞体系。通过荧光显微镜观察，结果表明，AT14A-GFP融合蛋白在细胞水平主要在质膜部位表达，而在植株水平主要在根尖表达。并且，完整植物材料体系的建立为研究AT14A蛋白的功能(尤其是其与细胞壁的关系和在植物响应干旱胁迫中的功能)奠定了基础。 2、悬浮细胞的表型观察发现，AT14A的缺失和过表达改变了细胞的形态。除了60％以上突变体细胞表现为球形，游离单细胞数目较野生型多，并且过表达转基因细胞团块比野生型大外，定量分析表明，野生型、缺失型突变体和过表达悬浮细胞在细胞壁厚度上也存在差异，具体表现为：野生型>过表达>突变体，拟南芥植株下胚轴细胞壁厚度的定量分析结果也表现了与悬浮细胞同样的规律，并且，下胚轴横切面超薄切片的电镜图片显示突变体细胞较野生型和过表达要大。各基因型拟南芥叶片气孔内壁厚度的变化趋势同下胚轴，即：野生型≈互补>过表达>突变体。 3、测定四种基因型细胞壁成分时发现，过表达植株纤维素含量较高，其次是野生型和互补型(基本相同)，纤维素含量最少的是缺失型突变体。四种基因型间果胶质含量差异不明显。进一步用双向电泳技术对以上四种基因型细胞壁蛋白进行分析得出四种基因型细胞壁中存在差异蛋白点。 4、四基因型拟南芥植株对干旱胁迫的反应不同。从形态学角度看，AT14A缺失型突变体和转AT14A-GFP融合基因过表达的拟南芥植株要比野生型植株更为抗旱。在相同的干旱胁迫进程下，缺失型突变体植株叶片的气孔导度和叶片水势的变化均比野生型大，这与其抗旱表型相一致。而转AT14A-GFP融合基因互补型与野生型几乎没有差别。但干旱胁迫对AT14A缺失型突变体和转AT14A-GFP融合基因过表达的拟南芥叶片中ABA含量的影响不大，这说明AT14A基因的缺失或过表达，影响了植物体内干旱胁迫诱导的ABA的合成过程。 以上结果表明，AT14A蛋白可能是拟南芥细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的中间成员之一，并与细胞形态改变、细胞壁组成变化之间存在密切关系。细胞壁和(或)细胞壁与细胞膜间的相互作用参与了细胞对干旱胁迫的感知以及干旱胁迫诱导细胞合成ABA的过程。

目录

文摘

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论文说明：中英文对照词

声明

第一章文献综述

1.1整合素蛋白

1.1.1整合素蛋白的结构与功能

1.1.2整合素蛋白的活化机制

1.2植物类整合素蛋白的研究进展

1.2.1植物类整合素蛋白存在与组织和细胞学定位

1.2.2植物类整合素蛋白的功能

1.2.3植物类整合素蛋白的研究展望

1.3植物细胞壁的结构与功能

1.3.1细胞壁的构成

1.3.2细胞壁的功能

1.3.3细胞壁的研究热点

1.4结语

第二章AT14A过表达和互补转基因植株及相关悬浮细胞培养体系的建立

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果分析

2.3.1拟南芥叶片总RNA的提取

2.3.2拟南芥叶片第一链cDNA的合成

2.3.3拟南芥AT14A序列TOPO克隆的PCR扩增

2.3.4转AT14A-GFP融合基因的双元载体的DH5α阳性克隆的PCR鉴定

2.3.5转AT14A-GFP融合基因的农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

2.3.6拟南芥缺失突变体at14a纯度的鉴定

2.3.7转AT14A-GFP融合基因植株的获得与鉴定

2.3.8转AT14A-GFP融合基因悬浮细胞的获得与鉴定

2.4讨论

第三章AT14A蛋白对细胞壁合成的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2主要仪器

3.2.3实验方法

3.3结果分析

3.3.1各基因型悬浮细胞体系细胞壁的差异比较

3.3.2各基因型植株体系细胞壁的差异比较

3.3.3各基因型植株和悬浮细胞细胞壁组分差异比较

3.3.4拟南芥细胞壁蛋白双向电泳胶分析结果

3.4讨论

第四章AT14A蛋白在拟南芥响应干旱胁迫中的生理功能分析

4.1引言

4.2植物材料

4.3试验方法

4.3.1干旱处理方法

4.3.2土壤含水量测定

4.3.3叶片水势测定

4.3.4气孔导度测定

4.3.5叶片内源ABA含量测定

4.4结果与分析

4.4.1四基因型拟南芥响应干旱胁迫的形态学变化

4.4.2干旱处理对土壤含水量的影响

4.4.3干旱处理对四基因型拟南芥叶片气孔导度的影响

4.4.4干旱处理对四基因型拟南芥叶片水势的影响

4.4.5干旱处理对四基因型拟南芥叶片ABA含量影响

4.5讨论

第五章总结与讨论

参考文献

附录

致谢

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