miR-144/451与β地中海贫血的关系及姜黄素的干预作用

摘要

β地中海贫血(β-thalassemia)是常见的单基因遗传性疾病，其发病机制是由于β珠蛋白基因突变引起β珠蛋白肽链合成减少或完全缺如，造成与β珠蛋白相匹配的α珠蛋白链表达相对过剩，过剩的α链在红细胞膜上沉淀形成包涵体，最终导致红细胞前体细胞凋亡增加等临床症状，属于慢性溶血性贫血的一种。流行病学调查发现目前全球β珠蛋白突变基因携带者超过7500万，β地中海贫血的突变类型达200多种。该疾病主要分布在地中海地区、中非洲、亚洲、南太平洋地区以及中国南方地区，在我国，广东、广西、海南、澳门及香港五省区为高发区。β地中海贫血发病率高，2009年广西自治区妇幼卫生监测到重症β地中海贫血发生率为2.58％。患者总体生存时间短，生存质量及预后差，且尚无有效治疗方法，为家庭、社会均造成严重负担。因此，探索安全有效的治疗方法，对人类β地中海贫血的治疗具有重要价值。
　　miRNA(microRNA)是一种非编码小分子RNA，通过与靶基因的特异性碱基互补结合，降低靶基因的稳定性或抑制其合成，参与多种生物的细胞发育、增殖及分化等过程，与人类多种疾病的发生发展密切相关。研究表明，miRNAs在红细胞分化和成熟过程中发挥重要作用。
　　miR-144和miR-451是一个双顺反子miRNA基因位点。2005年，miR-451从人脑垂体RNA中提取并命名，与miR-144相邻并定位于人类染色体17q11.2。在小鼠中，miR-144与miR-451相邻并位于11号染色体，该基因簇具有共同的转录调控启动子。迄今为止，作为小分子RNA，miR-144/451在成熟红细胞中表达量最高。RNA测序结果表明，miR-451的表达量约占据红细胞发育晚期miRNA的50％。大量体内外实验发现，miR-144/451在红细胞发育成熟过程中和珠蛋白合成中起到关键作用。在红细胞成熟晚期，miR-451表达紊乱会引起相应的红细胞成熟障碍或分化停滞，从而引起相应的疾病。例如在真性红细胞增多症、镰刀性贫血等多种血液系统疾病中存在miR-144/451的表达失调。有报道发现，β地中海贫血患者的前体红细胞中miR-451的表达上调。这些均提示miR-144/451参与红细胞疾病的发生，因此，研究miR-144/451在红细胞疾病中的表达失调及其作用机制可为开发新的靶向治疗药物提供依据。
　　机体内氧化应激所产生的活性氧类（reactive oxygen species，ROS）可损伤细胞内蛋白质、核酸等大分子物质的生理功能，是临床许多疾病发生发展的病理生理学基础。研究发现，核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)在保护机体免受氧化应激损伤的过程中起到关键作用，Nrf2通过与抗氧化反应元件(antioxidantresponsive element，ARE)结合后相互作用调节编码抗氧化蛋白的产生，是迄今为止发现的最重要的内源性抗氧化应激通路。生物信息学预测发现，miR-144可通过碱基互补原则与Nrf2的3'非翻译区（3'-untranslated region，3'UTR）绑定结合，研究发现miR-144在镰刀状贫血患者体内可靶向调控转录因子Nrf2的表达，从而在镰刀状贫血疾病的发展中起到关键的调控作用。β地中海贫血时，ROS水平是否有升高？此外，miR-144是否可通过碱基互补结合在Nrf2的3'UTR从而调控Nrf2的翻译表达进而调控β地中海贫血疾病的发生发展？
　　α血红蛋白稳定蛋白(Alpha-hemoglobin stabilizing protein，AHSP)，也称做红细胞系分化相关因子（erythroid differentiation-related factor, EDRF），在体内起到维持α和β珠蛋白稳定的关键作用。生理及病理状态下，AHSP与红细胞内游离的α珠蛋白结合形成复合物，可特异性使α珠蛋白保持溶解状态，阻止其沉淀。研究发现AHSP敲除小鼠红细胞形态改变，寿命缩短，且脾脏增大，β地中海贫血小鼠敲除AHSP后，小鼠贫血症状加剧，以上研究结果说明AHSP具有重要的生理作用。我们通过生物信息学预测发现miR-144/451成熟系列可通过碱基互补特异性结合AHSP的mRNA序列，但miR-144/451是否可调控AHSP的表达从而在β地中海贫血中起到作用，目前尚不清楚。
　　此外，大量研究发现γ珠蛋白的高表达可改善β地中海贫血。γ珠蛋白的表达水平与β地中海贫血患者贫血程度呈负相关。因此，各种提高γ珠蛋白表达的基因治疗等方法纷纷出现。然而，miR-144/451是否与γ珠蛋白之间存在直接或间接的关系，至今未见报道。
　　中药单体姜黄素(Curcumine)广泛存在于姜科植物姜黄根茎中，是其主要活性成分之一，研究表明姜黄素具有较强的抗炎抗氧化、调节免疫活性的生物作用，并且毒性较小，但在β地中海贫血治疗中姜黄素是否具有抗氧化功能从而起到改善贫血的作用，未见相关研究。
　　本课题组前期已发表的实验数据表明miR-144/451具有较强的抗氧化应激作用，其作用机制是通过抑制靶基因Ywhaz的翻译，导致靶蛋白的表达量减少，从而促进抗氧化酶的转录。同时，本课题组实验结果发现，β地中海贫血小鼠体内的miR-144/451表达量明显升高，将β地中海贫血模型小鼠与miR-144/451基因敲除小鼠杂交后，对杂交鼠进行相关基因型鉴定，发现当β地中海贫血小鼠体内miR-144/451表达缺失时，其贫血等症状明显改善。因此，本研究为进一步明确这种贫血改善的现象并阐明贫血改善的分子机制，以期为开发相关靶向治疗药物提供理论基础和实验依据。
　　本课题利用野生型小鼠（wt）、miR-144/451基因敲除鼠（miR-144/451-/-，mko）、β地中海贫血杂合子小鼠（βthalassemia heterozygote，βhet）作为体内研究对象，通过遗传学杂交方法将miR-144/451基因敲除的杂合子小鼠与β地中海贫血杂合子小鼠共同饲养杂交，得到miR-144/451基因部分敲除和完全敲除的2种β地中海贫血小鼠模型(mhet/βhet和mko/βhet)（β地中海贫血纯合子小鼠是胚胎致死型，所以无存活），通过利用wt、mko、βhet和mko/βhet共4组不同基因型小鼠，进行以下实验:1）检测miR-144/451在外周血、骨髓以及小鼠胚胎肝红细胞中表达趋势，进一步验证miR-144/451基因表达缺失后β地中海贫血改善的现象;2）通过体内外模型阐明miR-144/451功能缺失后β地中海贫血改善的可能分子机制;3）通过体内实验进一步明确姜黄素在β地中海贫血中发挥的抗氧化作用，以及姜黄素与miR-144/451在改善β地中海贫血症状中的相互关联。通过以上实验，本研究旨在明确miR-144/451与β地中海贫血的关系，阐明miR-144/451缺失后改善β地中海贫血的可能分子机制，并探讨姜黄素对β地中海贫血的干预作用，旨在为开发β地中海贫血及类似重症贫血的靶向治疗提供可靠的体内模型及理论依据，使得β地中海贫血临床患者受益。研究内容分为以下6个部分:
　　第一部分 miR-144/451基因敲除和β地中海贫血杂交小鼠模型的建立
　　目的:通过遗传学方法繁殖小鼠，并基因型鉴定明确各种小鼠基因型，统计各种基因型小鼠的生存率，明确miR-144/451缺失前后对β地中海贫血小鼠生存率的影响。
　　方法:通过遗传学方法将wt小鼠与miR-144/451敲除小鼠(miR-144/451-/-，mko)杂交，进行PCR基因型鉴定后得到miR-144/451杂合子小鼠(miR-144/451+/-，mhet)，将mhet小鼠与β地中海贫血杂合子(βhet)小鼠共同饲养，对子代小鼠进行PCR扩增基因型鉴定得到miR-144/451基因部分敲除和完全敲除的2种β地中海贫血小鼠模型(mhet/βhet和mko/βhet)，然后将亲代均为mhet/βhet的双杂合子小鼠杂交，根据孟德尔遗传定律统计子代各种基因型小鼠的存活数量。
　　结果:通过遗传学杂交方法得到的所有子代小鼠共2123只小鼠，其中，wt小鼠321只，β地中海贫血(mwt/βhet，βhet)小鼠68只，miR-144/451缺失的β地中海贫血(mko/βhet)小鼠120只，双杂合子（mhet/βhet）小鼠249只，其中mko/βhet小鼠总的生存数多于mwt/βhet;将亲代基因型均为mhet/βhet的小鼠进行杂交后，统计子代小鼠共541只，其中wt小鼠103只，βhet小鼠33只，mko/βhet小鼠49只，其中mko/βhet小鼠总的生存数也多于mwt/βhet。
　　结论:与βhet组比较，miR-144/451表达缺失后β地中海贫血小鼠存活率显著升高。提示miR-144/451可能参与β地中海贫血的发生发展，有望作为新的分子标靶干预β地中海贫血的治疗及预后。
　　第二部分 miR-144/451在β地中海贫血小鼠体内的表达变化
　　目的:明确miR-144/451在β地中海贫血小鼠体内的表达情况，为进一步探讨miR-144/451对β地中海贫血的作用机制奠定基础。
　　方法:通过胚胎干细胞富集试剂盒和FCM分选出:1）wt小鼠、βhet小鼠14.5天胚胎肝细胞中的胚胎干细胞;2）两种基因型小鼠的骨髓有核红细胞（脱核前）和网织红细胞（脱核后）;3）β地中海贫血小鼠外周血中的成熟红细胞及网织红细胞;提取胚胎肝细胞中的胚胎干细胞、骨髓有核红细胞和网织红细胞、外周血红细胞中的总RNA，进行反转录成cDNA，并运用qRT-PCR技术检测miR-144和miR-451的表达情况。
　　结果:与wt小鼠比较，miR-144和miR-451在β地中海贫血小鼠14.5天的胚胎干细胞中表达显著性升高;miR-144/451在骨髓有核红细胞及网织红细胞中的表达均显著升高;β地中海贫血小鼠外周血红细胞中miR-144/451的表达也显著性升高，且网织红细胞中表达趋势和成熟红细胞中一致。
　　结论:miR-144/451在β地中海贫血小鼠红细胞的不同发育阶段均有显著性升高，提示miR-144/451参与了β地中海贫血的发病过程。
　　第三部分 miR-144/451基因表达缺失改善β地中海贫血的作用
　　目的:明确miR-144/451基因缺失表达后对β地中海贫血的影响。
　　方法:通过检测4组基因型小鼠（wt，mko，βhet，mko/βhet）的外周血细胞参数，明确各种小鼠贫血情况;制作外周血涂片，并进行瑞氏-吉姆萨染色、网织红细胞染色液染色、α-沉淀(Heinz body)结晶紫染色、普鲁士蓝染色等方法，明确4组小鼠外周血中红细胞形态、数量及是否存在铁沉积的变化;运用流式细胞技术检测4组小鼠外周血和骨髓中的红细胞，明确红细胞的分化成熟度;运用流式细胞仪检测外周血中网织红细胞数量，明确红细胞成熟度;检测4种小鼠脾脏的形态学及组织学变化，明确各组小鼠的代偿性造血水平。
　　结果:1）外周血涂片瑞氏-吉姆萨染色结果提示:与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠外周血红细胞形态明显改善，红细胞大小较均匀，靶形红细胞减少，中心淡染区减小，网织红细胞计数明显减少;2）网织红细胞染色结果提示:与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠的外周血网织红细胞染色阳性比例明显减少;3）α-沉淀(Heinz body)结晶紫染色结果提示:与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠的外周血红细胞中的沉淀明显减少，有显著统计学意义;4）普鲁士蓝染色结果提示，与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠的外周血红细胞中铁沉积减少;5）流式细胞仪检测结果提示:与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠的外周血中网织红细胞比例明显下降，且骨髓及外周血的红细胞成熟度明显改善;6)脾脏形态学及组织学结果提示:与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠的脾脏明显减小，重量显著性减轻，组织学结果提示脾脏中红细胞数量明显减少，脾脏铁沉积也明显改善，提示小鼠体内代偿性造血功能改善。
　　结论:miR-144/451基因缺失表达后可显著改善β地中海贫血。说明miR-144/451参与了β地中海贫血红细胞的成熟过程，可作为新的分子标靶干预红细胞疾病的治疗及预后。
　　第四部分 miR-144/451基因缺失促进Nrf2的转录活性改善β地中海贫血的分子机制
　　目的:流式细胞仪分选出4种不同基因型小鼠的骨髓有核红细胞后，进行mRNA芯片;检测β地中海贫血小鼠外周血中ROS表达，对比4种不同基因型小鼠外周血中的ROS水平，明确miR-144/451缺失表达后ROS水平明显下降。阐明miR-144通过作用于靶基因Nrf2，间接调控Nrf2下游各种抗氧化应激酶的表达，明确miR-144/451缺失表达改善β地中海贫血的分子机制。
　　方法:流式细胞仪分选出4种不同基因型小鼠的骨髓有核红细胞，进行mRNA芯片聚类分析，筛查出在miR-144/451基因缺失后有显著表达变化的mRNA。通过眼眶采血得到4种不同基因型小鼠的外周血，DCFH-DA孵育标记后，流式细胞仪检测外周血红细胞中的ROS表达;并予以过氧化氢(H2O2)作用红细胞后检测ROS;通过生物信息学网站TargetScan及miRbase等数据库的查询预测miR-144可通过碱基互补特异性结合在Nrf2的3'UTR端;T4克隆构建过表达miR-144/451的MSCV-PIG逆转录病毒载体，运用双荧光素酶报告实验在293T细胞进一步验证miR-144与Nrf2的绑定关系，确定Nrf2为miR-144的靶基因;Terl19磁珠抗体分选出不同基因型小鼠的骨髓有核红细胞，qRT-PCR及Western Blot验证miR-144在转录水平及转录后水平对Nrf2表达的影响，应用qRT-PCR检测Nrf2下游各种抗氧化应激酶包括SOD、Catalase、GPX1、NQO1的表达变化。
　　结果:1）骨髓有核红细胞mRNA芯片结果聚类分析提示4组不同基因型的mRNA表达有显著变化;2）流式细胞仪检测结果提示，与wt小鼠比较，βhet组小鼠ROS水平明显升高;与βhet组比较，mko/βhet组小鼠的ROS水平显著下降;3）miR-144可通过特异性碱基互补作用于Nrf2的3'UTR端，从而在翻译水平上抑制Nfr2的表达;4）与βhet组比较，mko/βhet组小鼠体内Nrf2及下游的抗氧化酶SOD、NQO1的相对表达量明显升高。
　　结论:1）明确β地中海贫血小鼠体内氧化应激水平明显升高，miR-144/451基因缺失后氧化应激水平改善;2）阐明miR-144/451基因缺失表达后可显著改善β地中海贫血的分子机制:miR-144/451缺失表达后，靶基因Nrf2的表达量及转录活性升高，引起抗氧化酶包括SOD、NQO1的表达增加;3）为β地中海贫血的靶向治疗提供可靠的理论依据。
　　第五部分 miR-144/451功能缺失促进AHSP表达改善β地中海贫血的分子机制研究
　　目的:明确miR-144/451缺失表达后AHSP表达的变化，进一步阐明miR-144/451可调控靶基因AHSP的表达，调节AHSP与α珠蛋白的结合，减少红细胞中Heinz Body的沉积，从而验证miR-144/451功能缺失在改善β地中海贫血的症状中的另一可能机制，为开发β地中海贫血的临床新治疗提供理论依据。
　　方法:通过生物信息学网站TargetScan及miRbase等数据库的查询预测miR-144和miR-451成熟系列可通过特异性碱基互补原则分别结合在AHSP的编码区及5'UTR端;T4克隆构建过表达miR-144/451的MSCV-PIG逆转录病毒载体，并构建含有miR-144/451绑定序列的AHSP和突变了miR-144/451绑定序列的AHSP的PGL3-BS质粒载体，运用双荧光素酶报告实验在293T细胞中进一步验证miR-144/451与AHSP的绑定关系，确定miR-144/451可靶向作用于AHSP;体外培养MEL细胞，验证miR-144/451对AHSP表达的抑制作用;磁珠分选出不同基因型小鼠的骨髓有核红细胞，qRT-PCR及Western Blot验证miR-144/451在转录水平及转录后水平对AHSP的影响，结晶紫染色明确红细胞中α-沉淀的表达变化。
　　结果:1）miR-144/451可通过特异性碱基互补作用于AHSP的编码区及5'UTR端，在翻译水平上抑制AHSP蛋白的表达;2）与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠外周血及骨髓有核红细胞中AHSP的mRNA表达升高，蛋白表达量也升高;3）与βhet组小鼠比较，mko/βhet组小鼠外周血涂片结晶紫染色提示红细胞中α沉淀显著性减少。
　　结论:阐明miR-144/451基因缺失表达后显著改善β地中海贫血的分子机制:miR-144/451缺失表达后，靶基因AHSP的表达量升高，高表达的AHSP可结合较多的α珠蛋白，减少α珠蛋白在红细胞膜上的沉淀，红细胞破坏减少，从而起到改善贫血的作用。这将为进一步开发针对miR-144/451的小核酸类抑制剂治疗β地中海贫血提供又一个可靠的理论依据。
　　第六部分姜黄素通过调节氧化应激善β地中海贫血的研究
　　目的:研究姜黄素（Curcumin，CUR）调节氧化应激的作用，探讨其改善β地中海贫血的效果，为传统中医中药治疗β地中海贫血提供理论参考。
　　方法:实验小鼠分为4组，分别为wt，wt+姜黄素，βhet，βhet+姜黄素。参考研究文献，予以腹腔注射姜黄素（剂量为50 mg/kg）21天后，全血细胞仪测定4组小鼠外周全血细胞计数，并取外周血DCFH-DA孵育标记后流式细胞仪检测ROS表达变化，统计4组小鼠脾脏大小形态的差异;检测4组小鼠体内抗氧化应激酶SOD、NQO1、Catalase和GPX1的表达，明确姜黄素对βhet小鼠抗氧化应激酶的影响;检测小鼠外周中miR-144/451的表达变化，阐明姜黄素作用的可能机制。
　　结果:1）姜黄素可显著改善βhet外周血的各项指标，改善小鼠体内的代偿性造血状态;2）姜黄素可通过显著性提高抗氧化酶SOD、NQO1的mRNA表达，降低ROS的水平，缓解氧化应激损伤;3）姜黄素可显著降低β地中海贫血小鼠脾脏的大小形态，改善小鼠代偿性造血;4）姜黄素可显著性降低β地中海贫血小鼠外周血及骨髓中的miR-144的表达，对miR-451有降低趋势，但无统计学差异。
　　结论:1）姜黄素可改善β地中海贫血，改善外周血红细胞形态;2）姜黄素可改善β地中海贫血脾脏的代偿造血状态;3）姜黄素可降低miR-144/451的表达，并通过促进抗氧化酶SOD和NQO1的表达，降低β地中海贫血小鼠的ROS水平，减少ROS对红细胞的破坏。该研究将为中医药治疗β地中海贫血提供新的理论依据。

目录

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 miR-144／451基因敲除和β地中海贫血杂交小鼠模型的建立

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 miR-144／451在β地中海贫血模型小鼠中的表达

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 miR-144／451基因表达缺失改善β地中海贫血的作用

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 miR-144／451功能缺失促进Nrf2的转录活性改善β地中海贫血的分子机制

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第五部分 miR-144／451功能缺失促进AHSP表达改善β地中海贫血的分子机制

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第六部分 姜黄素调节氧化应激改善的β地中海贫血的研究

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 β地中海贫血的治疗进展及其与microRNA关系

致谢

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