白术多糖对大肠杆菌腹泻模型小鼠肠道黏膜修复机理研究

摘要

大肠杆菌腹泻是兽医临床常见的致死率较高病症之一。为了科学研究不同药物对于大肠杆菌腹泻的防治机制，许多研究者通过建立试验动物大肠杆菌腹泻模型，如大鼠、小鼠、兔和豚鼠等，观察检测模型动物的腹泻情况，临床症状，组织器官病理变化和肠道黏膜修复相关的细胞因子（如EGF、TGF-β、TGF-α等），并且肠道黏膜修复相关细胞因子的表达水平可评估药物对于受损肠道的作用。
　　本研究以白术多糖能缓解大肠杆菌腹泻症状为目标，在建立小鼠大肠杆菌腹泻模型的基础上，以白术健脾益气，能医泄利，保护肠道等功能为切入点，通过统计大肠杆菌腹泻小鼠腹泻率，腹泻指数，观察小鼠临床症状，剖检症状，组织学形态变化，超微结构变化，并利用免疫组化和实时荧光相对定量法检测肠道黏膜修复细胞因子和基因的表达情况，来探索评价白术多糖对于大肠杆菌腹泻的作用，并初步探讨其防治腹泻的机制。
　　试验一小鼠大肠杆菌腹泻模型的建立
　　本试验通过构建小鼠大肠杆菌感染模型，观察小鼠腹泻情况、临床症状与剖检症状，应用切片技术、电镜技术对小鼠的组织学变化和超微结构变化进行观察。方法:将20只ICR小鼠随机。分成两组，模型组与空白组。模型组腹腔注射大肠杆菌O1115.4×107cfu/ml，空白组注射等体积生理盐水，统计小鼠的稀便级，计算稀便率，剖检小鼠，制作H.E切片、透射电镜切片、扫面电镜样品。结果:24h时，模型组小鼠腹泻率为100％，腹泻指数为0.34，与空白组差异显著，腹泻模型成功造模成功;攻菌后24h后，模型组小鼠各段肠道均有损伤;十二指肠的损伤较为严重，肠绒毛变短，绒毛结构被破坏，肠壁破损;透射电镜下可观察到模型组线粒体肿胀，粗面内质网扩张。
　　试验二白术多糖对小鼠大肠杆菌腹泻防治效果的影响
　　本试验通过研究白术多糖对腹泻小鼠的临床症状、剖检变化的影响，探讨白术多糖对大肠杆菌造成小鼠腹泻的防治效果，为揭示白术多糖对小鼠腹泻的防治机制提供前提。方法:购买白术粉末用醇沉法制白术多糖，制得粗多糖后用苯酚-硫酸法测定多糖含量，结果:白术含多糖38.76％。随机选取ICR小鼠100只随机分为4组，即空白组，治疗组，预防组，阳性组，每组25只。预防组提前3d灌胃白术多糖0.04mg/ml，0.2ml/只（多糖:0.0059mg/只）。治疗组，预防组，阳性组腹腔注射大肠杆菌5.4×107cfu/ml（0.1 ml/只），空白对照组注射等体积生理盐水。观察小鼠的腹泻情况。分别于1h，8h，24h，48h，72h，96h，120h每组扑杀剖检3只小鼠。记录小鼠剖检情况。结果:阳性组6h开始出现腹泻症状，预防组与治疗组8h开始出现腹泻症状，剖检发现预防组小鼠小肠有轻微出血症状，治疗组小鼠十二指肠暗红充血，肠壁变薄，阳性组小鼠肠道充血出血，十二指肠段充血较严重;24h时阳性组的腹泻率为82.6％，与预防组43.48％和治疗组34.8％差异显著(P＜0.05)，阳性组的腹泻指数也显著高于预防组与治疗组（P＜0.05）;96h后，预防组与治疗组开始好转，阳性组小鼠剖检发现症状较严重，用药组小鼠恢复时间较短，肠道恢复情况较好。结果表明白术多糖对大肠杆菌所导致的小鼠腹泻有一定的防治效果，主要体现在腹泻初期白术多糖减缓腹泻症状，保护肠道粘膜，对于大肠杆菌所致腹泻的后续治疗有一定效果。
　　试验三白术多糖对大肠杆菌腹泻小鼠肠道组织形态学的影响
　　为进一步探究白术多糖对受损肠道黏膜的影响，本试验使用白术多糖作用于大肠杆菌腹泻模型的小鼠，观察小鼠组织形态和超微组织形态变化，进一步探索白术多糖对小鼠腹泻的防治机制。方法:多糖制备和小鼠分组处理方法同试验二，小鼠分别于1h，8h，24h，48h，72h，96h，120h时每组剖检3只小鼠，取十二指肠制作H.E切片、扫描电镜切片与透射电镜切片，结果表明，攻菌后1h，预防组无较明显病变;治疗组肠腺出血，轻微水肿，扫描电镜下肠绒毛较整齐;阳性组肠腺有出血，肠绒毛开始萎缩，扫描电镜下绒毛顶端脱落损坏，部分绒毛萎缩。24h时，阳性组肠绒毛大量损坏脱落，症状较预防组与治疗组严重。96h时预防组与治疗组开始好转，阳性组症状严重。透射电镜下可观察到，小鼠腹泻中期时即24h之后，用药组小鼠肠上皮细胞微绒毛排列较整齐，线粒体肿胀，核变形，内质网扩张;阳性组小鼠肠上皮细胞微绒毛减少，倒伏，细胞核高度不规则，大量线粒体变性形成髓鞘样结构，内质网大量扩张含有颗粒状包涵体。结果表明白术多糖用药组对于小肠上皮细胞微绒毛保护较好，白术多糖具有保护肠道粘膜的作用，参与细胞代谢的粗面内质网、线粒体等细胞器的病变程度较轻说明白术多糖可能对肠道因子有有益的调节作用。
　　试验四白术多糖对大肠杆菌腹泻小鼠肠道修复机制的研究
　　本试验通过免疫组化和real time PCR的方法来研究肠道损伤后，随着时间的变化，白术多糖对肠道内的表皮生长因子受体EGFR和TGF-β1（转化生长因子-β1）的影响。方法:药物制备与小鼠分组处理同试验二，分别于1h，8h，24h，48h，72h，96h，120h每组扑杀剖检3只小鼠，制作免疫组化切片和用real time PCR法来检测肠道中EGFR和TGF-β1的表达情况。结果:腹泻初期，空白组与其余各组小鼠EGFR阳性染色大部分出现在隐窝上皮细胞的细胞质上;TGF-β1阳性染色位于小肠淋巴细胞、巨噬细胞以及部分小肠上皮细胞的胞浆内;此时各组EGFR和TGF-β1的表达量与空白组无显著性差异;腹泻中期，肠黏膜损伤最为严重，此时EGFR与TGF-β1出现大量阳性染色，此时EGFR与TGF-β1表达量分别达到峰值，各组表达量与空白组相比差异显著(P＜0.05);腹泻后期，预防组与治疗组EGFR表达量与24h相比降低但差异不显著，阳性组EGFR表达量大幅度减少，差异极显著（P＜0.01），说明白术多糖能影响EGFR的表达，使其维持在一个较高的表达水平中，促进上皮细胞快速增殖;各组TGF-β1阳性表达减弱，但预防组与治疗组TGF-β1表达量较高，说明白术多糖对于TGF-β1有调节作用，通过调节TGF-β1来促进肠道黏膜修复。
　　结论:白术多糖对大肠杆菌诱导的小鼠腹泻有一定防治效果，能有效减缓腹泻症状，减少小鼠的腹泻率。剖检发现对腹泻小鼠的肠道有明显的保护作用，预防组小鼠的保护效果最好，恢复时间最短。观察超微组织学变化发现白术多糖对肠上皮细胞的微绒毛、线粒体、内质网等具有保护作用，促进细胞较快的恢复正常代谢。主要原因是白术多糖对肠道黏膜修复因子EGFR和TGF-β1的调节，促进肠道黏膜修复，从而在腹泻初期白术多糖能有效的保护肠道粘膜，腹泻中后期白术多糖能使黏膜上皮细胞的更早恢复正常代谢。

目录

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

1．肠出血性大肠杆菌生物特性及致病机制

1．1 肠出血性大肠杆菌的生物特性

1．2 肠出血性大肠杆菌致病机制

2．大肠杆菌诱导的小鼠腹泻模型研究进展

3．肠道黏膜修复相关的细胞因子

3．1 表皮生长因子与表皮生长因子受体

3．2 转化生长因子-β

4．白术及其主要成分在现代医学上的研究进展

4．1 白术挥发油的研究现状

4．2 白术苷类成分

4．3 白术多糖

参考文献

第二部分 试验研究

试验一 小鼠大肠杆菌腹泻模型建立

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

参考文献

试验二 白术多糖对小鼠大肠杆菌腹泻防治效果的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论与分析

参考文献

试验三 白术多糖对大肠杆菌腹泻小鼠肠道组织形态学的影响

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论与分析

参考文献

试验四 白术多糖对大肠杆菌腹泻小鼠肠道修复机制的研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

附图

参考文献

全文结论

致谢

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