H9N2亚型流感病毒HA蛋白糖基化位点变化影响病毒生物学特性的研究

摘要

H9N2亚型流感病毒(IAV)最早于1966年在北美的火鸡中被检测到，随后在世界范围内广泛流行，给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。H9N2亚型流感病毒经过20多年在多种动物中的传播，其HA基因发生了较多的突变，其中包括糖基化位点数量的变化或者位置的转移。本论文通过对近20年60株H9N2亚型流感病毒HA蛋白的潜在糖基化位点的分析，发现随着时间的推移（1994-2014年），部分H9N2亚型病毒的HA蛋白218位从先前的潜在糖基化位点变异为非糖基化位点，而313位从先前的非糖基化位点变为潜在糖基化位点，并且在218位潜在糖基化位点发生缺失的病毒中，其313位全部变成了潜在糖基化位点。本实验拟探究H9N2亚型流感病毒在HA蛋白的218和313位糖基化位点的变化对H9N2亚型流感病毒生物学特性的影响。
　　1.H9N2亚型流感病毒HA蛋白313/218位糖基化位点变异的构建及病毒拯救
　　本论文以1998年分离的Ck/SH/F/98(H9N2)（以下简称为F/98株）流感病毒为骨架，以F/98株的HA为模板，通过分子克隆技术，构建获得在F/98株HA基因的313位增加一个糖基化位点的转录/表达质粒pHW204-HA/313G+，和在HA基因的313位增加一个糖基化位点时，在218位同时减少一个糖基化位点的转录/表达质粒pHW204-HA/218G-313 G+;将转录/表达质粒pHW204-HA/313G+、pHW204-HA/218G-313G+，分别与F/98株的其余7个基因的转录/表达质粒pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW206-NA、pHW207-M、pHW208-NS组成八质粒系统，经反向遗传学技术拯救病毒，拯救出在F/98株的HA蛋白313位增加一个糖基化位点的病毒rF/HA313 G+，和在HA蛋白218位减少一个糖基化位点并在313位增加一个糖基化位点的病毒rF/HA218G-/313 G+。将rF/HA313G+和rF/HA218G-/313G+病毒经Western-blot鉴定发现，与F/98株病毒的HA蛋白的迁移率比较，病毒rF/HA313G+HA蛋白的迁移速率明显降低;而病毒rF/HA218G-/313G+HA蛋白的迁移速率位于F/98株与rF/HA313G+株之间，表明218位和313位的潜在糖基化都是功能性糖基化位点。
　　2.HA蛋白313/218位糖基化位点变异对病毒生物学特性的影响
　　为了研究HA蛋白糖基化位点变化对病毒生物学特性的影响，本实验以母本病毒F/98株为对照、对rF/HA313G+和rF/HA218G-/313G+株病毒进行了鸡胚半数感染量(EID50)、鸡胚半数致死量(ELD50)、细胞半数感染量(TCID50)测定、对鸡的致病性和传播途径特性以及交叉免疫保护特性的研究。将病毒的EID50和TCID50结果对比发现:与母本病毒F/98株比较，rF/HA313G+病毒的鸡胚和细胞感染能力分别增加了6.76倍和7.07倍，而rF/HA218G-/313G+病毒的感染力没有显著差异;与rF/HA313G+病毒株比较，rF/HA218G-/313G+病毒的鸡胚和细胞感染力分别降低了5.62倍和6.02倍。感染病毒鸡的气管和肺组织中的EID50结果显示，与母本病毒F/98株比较，在病毒攻毒后3d和5d，rF/HA313 G+病毒在鸡气管中的复制滴度分别增加了5.62倍、3.16倍，肺组织中的复制滴度都增加了3.16倍;与rF/HA313G+病毒株比较，在攻毒后3d和5d，rF/HA218G-/313G+病毒在鸡气管中的复制滴度比rF/HA313G+病毒分别下降了3.16倍、1.78倍，在肺组织中的复制滴度比rF/HA313G+病毒都下降了3.16倍;rF/HA218G-/313G+病毒在气管和肺组织中的复制滴度与F/98株相比没有显著差异。三株病毒的传播特性实验结果发现病毒F/98、rF/HA313G+和rF/HA218 G-/313 G+都可以通过直接接触和气溶胶传播;病毒的交叉免疫保护实验结果发现，免疫F/98株疫苗的鸡，经F/98、rF/HA313G+和rF/HA218 G-/313 G+的攻毒后，在气管和泄殖腔都没有分离到病毒，表明表明313、218位潜在糖基化位点的变化对病毒的气溶胶传播特性和抗原性没有影响。
　　以上结果表明H9N2流感病毒的HA蛋白中313/218位糖基化位点的变化影响了病毒对鸡胚和鸡的感染力和病毒在组织中的复制能力，但313/218位糖基化位点对病毒的气溶胶传播特性和抗原性没有影响。

目录

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

1 流感病毒生物学特性概述

1．1 H9N2亚型流感病毒的流行病学和传播概况

1．2 H9N2亚型流感病毒引起感染动物的临床症状和大体病理变化

1．3 H9N2亚型流感病毒的抗原变异

1．4 H9N2亚型流感病毒的疫苗应用

1．5 H9N2亚型流感病毒的遗传特性和生物进化概况

1．6 H9N2亚型流感病毒在动物模型中的毒力，传播特性和分子机制

1．7 H9N2亚型流感病毒是新型流感病毒的基因供体

2 A型流感病毒血凝素(HA)中的N-连接糖基化位点概述

2．2 A型流感病毒HA头部结合域上糖基化的差异性

2．3 HA糖基化影响了IAV对先天性免疫系统中凝集素的敏感性

2．4 HA糖基化模式对IAV生物学特性的影响

参考文献

第二部分 实验内容

第一章 H9N2亚型流感病毒HA蛋白糖基化位点突变的构建及病毒拯救

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 HA蛋白糖基化位点变化对病毒生物学特性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

声明