杆状病毒晚期表达因子ac14、ac40和ac62基因功能研究

摘要

杆状病毒基因的转录分为早期和晚期，晚期基因的表达开始于病毒DNA复制之后，晚期基因由病毒自身编码的RNA聚合酶转录，除了RNA聚合酶外，病毒还编码了一些晚期表达因子调控晚期基因的表达，这些因子保证了杆状病毒晚期基因的正常转录和翻译。
　　在杆状病毒AcMNPV中，根据同源性分析，推测ac14、ac40和ac62基因可能是病毒的晚期表达相关因子，但它们的具体功能尚不清楚。
　　本文分别对ac14、ac40和ac62基因进行实验分析，分别构建了缺失型及拯救型重组病毒粒子。转染和感染细胞，光学显微镜、荧光显微镜观察发现，缺失ac14、ac40、ac62三个基因的任何一个，病毒都失去增殖能力，但是拯救型病毒具有感染性。进一步电镜切片观察结果发现，缺失这些基因后，病毒核衣壳无法组装，因此病毒失去感染性。另外，缺失病毒也无法形成多角体。
　　除了回复完整的ac14基因的病毒外，又将全长为801bp的ac14基因截短成1-501bp、1-654bp、1-693bp三段分别插入缺失ac14的病毒基因组中，构建重组病毒粒子。在对全长或截断型ac14的回复病毒感染分析中，发现全长及截短型1-693的回复病毒和野生型病毒具有相似的感染水平，在感染后96h均达到了很高的滴度。这表明片段1-693可以完全拯救缺失病毒增殖能力，但是截断型1-501不能拯救缺失病毒增殖能力，而截断型1-654虽然可以拯救病毒的增殖能力，但病毒增殖缓慢。
　　通过将三个晚期表达因子分别融合EGFP进行亚细胞定位分析，结果显示AC14主要定位于细胞质。而AC40、AC62定位于细胞质和细胞核，病毒感染晚期这两个蛋白分别在细胞核中部和边缘有聚集的现象，可能与其在感染晚期执行晚期基因表达调控的功能相关。
　　另外还分别将晚期启动子Pp6.9与Pvp39和极晚期启动子Ppolh控制的egfp表达框，分别转座插入缺失ac14、ac40或ac62的重组病毒基因组中构建重组病毒，用以分析这些基因缺失对病毒晚期及极晚期启动子的影响。结果显示，任何一个基因缺失的重组病毒中，晚期和极晚期启动子都有微弱表达。其中，ac14基因缺失的重组病毒中，Pp6.9、Pvp39、Ppolh的启动子表达强度稍大;而在ac40、ac62基因缺失的重组病毒中，Pp6.9、Pvp39、Ppolh的启动子只有非常微弱的表达。晚期和极晚期启动子相比之下，极晚期Ppolh的表达更弱一些。
　　本实验对AcMNPV中ac14、ac40和ac62三个基因进行了基础性研究，结果表明它们都是AcMNPV的必需基因，缺失后病毒失去增殖能力。另外，三个基因都影响晚期和极晚期基因的表达，其中ac40和ac62缺失后，晚期及极晚期启动子表达能力大大下降。而ac14缺失后对晚期和极晚期启动子的影响相对较小。另外还发现ac14基因1-654bp区域对于病毒的增殖是必需的。这些发现为进一步揭示晚期基因的表达机制提供了理论基础。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 杆状病毒的概论

1．1．1 杆状病毒的简介

1．1．2 杆状病毒的分类及形态

1．1．3 杆状病毒复制周期

1．2 杆状病毒分子生物学研究概况

1．2．1 杆状病毒的基因组

1．2．2 病毒DNA复制与基因组加工

1．2．3 核心基因

1．2．4 杆状病毒基因表达时序性

1．2．5 杆状病毒相关蛋白的分类

1．3 杆状病毒的应用

1．3．1 杆状病毒作为生物杀虫剂

1．3．2 Bac-to-Bac系统

1．3．3 杆状病毒表面展示系统

1．3．4 杆状病毒应用于基因治疗

1．3．5 杆状病毒表达载体制备疫苗

1．4 晚期表达相关因子的研究进展

1．5 ac14、ac40、ac62基因背景知识

1．6 本论文研究的意义和目的

第二章 ac14基因功能的研究

2．1 实验材料

2．1．2 细胞系及培养基

2．1．3 酶、试剂、抗生素和试剂盒

2．1．4 重组病毒质粒与引物

2．2 实验方法

2．2．1 PCR反应程序及体系

2．2．2 试剂盒回收PCR产物和酶切产物

2．2．3 酶切反应

2．2．4 酶连反应

2．2．5 制备感受态细胞

2．2．6 质粒转化(转座)感受态细胞

2．2．7 提取质粒的方法

2．2．8 Bacmid的转染感染

2．2．9 滴度测定并绘制病毒一步生长曲线

2．2．10 电镜切片的制备

2．2．11 亚细胞定位的制片方法

2．3 实验结果

2．3．1 缺失ac14基因AcBacmid(vAcac14-ko-PH-PG)的构建

2．3．2 ac14基因拯救型重组病毒的构建

2．3．3 缺失型、拯救型和野生型病毒Bacmid转染细胞

2．3．4 电镜观察缺失型、拯救型和野生型重组病毒粒子

2．3．5 AC14蛋白的亚细胞定位

2．3．6 截短重组病毒的构建

2．3．7 截短型重组病毒Bacmid转染细胞

2．3．8 所有重组病毒感染Sf9细胞的一步生长曲线

2．4 讨论

第三章 ac40基因功能的研究

3．1 实验材料

3．1．1 菌种、质粒

3．1．2 细胞系及培养基

3．1．4 重组病毒质粒与引物

3．3．1 缺失ac40基因AcBacmid(vAcac40-ko-PH-PG)的构建

3．3．2 ac40基因拯救型重组病毒的构建

3．3．3 缺失型、拯救型和野生型病毒Bacmid转染细胞

3．3．4 所有重组病毒感染Sf9细胞的BV生长曲线

3．3．5 电镜观察缺失型、拯救型和野生型重组病毒粒子

3．3．6 AC40蛋白的亚细胞定位

3．4 讨论

第四章 ac62基因功能的研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌种、培养基、酶、试剂、抗生素和试剂盒

4．1．2 重组病毒质粒与引物

4．3 实验结果

4．3．1 缺失ac62基因AcBacmid(vAcac62-ko-PH-PG)的构建

4．3．2 ac62基因拯救型重组病毒的构建

4．3．3 缺失型、拯救型病毒Bacmid转染细胞

4．3．4 所有重组病毒感染Sf9细胞的BV生长曲线

4．3．5 电镜观察缺失型、拯救型和野生型重组病毒粒子

4．3．6 AC62蛋白的亚细胞定位

4．4 讨论

第五章 ac14、ac40和ac62基因的缺失对晚期启动子的影响

5．1 实验材料

5．1．1 菌种、质粒

5．2．1 方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

主要结论

参考文献

致谢

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