德尔卑沙门菌CRISPRS分子分型及全基因组测序分析

摘要

德尔卑沙门菌是重要的人兽共患病原菌，可引起人的全身性系统疾病，国内外均有该菌在医院内引起婴幼儿腹泻疾病暴发的案例。美国CDC数据显示德尔卑沙门菌在猪肉生产链中的分离率逐渐趋于首位。德尔卑沙门菌不仅可以引起猪的长程感染，而且可以在猪的各脏器内定植，同时又不会引起猪明显的临床症状，所以容易被人们忽略。最近研究发现德尔卑沙门菌在蛋鸡和鸡肉中的分离率也呈逐渐上升趋势，这对食品安全造成了新的威胁。因此，有必要对德尔卑沙门菌进行系统研究，从而为该菌的防控提供科学支撑。
　　本研究以CRISPRS序列为基础首次对德尔卑沙门菌进行基因分型。根据分型结果选取有代表性的两株德尔卑沙门菌进行全基因组测序，解读德尔卑沙门菌基因组的遗传信息，分析其在基因组上的差异。
　　1.德尔卑沙门菌CRISPRS分子分型
　　2015年5月至2016年4月，对扬州市T和S两个农贸市场猪肉样品进行沙门菌流行病学调查。共进行4次采样，采集151份猪肉样品，分离得到沙门菌84株，阳性率为55.6％。不同批次（春季、夏季、秋季、冬季）样品沙门菌分离率波动较大，从45.6％-75.0％不等。T市场沙门菌的分离率为65.7％，S市场沙门菌的分离率为47.6％，二者具有显著性差异(P＜0.05)。对84株沙门菌分离株进行血清型鉴定，共鉴定出14种血清型，其中德尔卑沙门菌24株，占总数的28.6％，为优势血清型，其余主要血清型还包括罗森沙门菌15株(17.9％)、鸭沙门菌11株(13.1％)、明斯特沙门菌10株(11.9％)、鼠伤寒沙门菌9株(10.7％)。
　　本实验室前期检测了生猪、猪肉、腹泻病人、鸡肉、犬及鹅样品中沙门菌，共分离出德尔卑沙门菌376株，结合本次分离到的24株德尔卑沙门菌共400株进行CRISPRS分型研究。通过对CRISPRS基因位点分析发现，德尔卑沙门菌均含有2个CRISPRS位点，即CRISPR1和CRISPR2，共101种间隔序列。CRISPR1中共检出62种不同的间隔序列，其中18种是新发现间隔序列;CRISPR2中共检出39种不同的间隔序列，其中17种为新发现间隔序列;CRISPR1位点间隔序列数量要多于CRISPR2位点间隔序列，其多态性也高于CRISPR2位点。根据菌株间隔序列的分布，400株德尔卑沙门菌被分为51种CRISPRS型(DCT)，其中以DCT24和DCT31型为最优势CRISPRS型，分别有110株和109株。通过对51种CRISPRS型进行进化树的分析，51种CRISPRS型被分为L1和L2两个谱系，而这两个谱系又被分为数个亚系。研究发现谱系L1所有菌株MLST分型均为ST40，谱系L2所有菌株多位点序列分型结果均为ST71，从这两个谱系CRISPRS位点间隔序列的分布来看只有2个相同的间隔序列，其余均不相同，表明这两个谱系的菌株亲缘关系较远，可能来源于不同的祖先。
　　来自扬州地区屠宰场、农贸市场及人源的264株德尔卑沙门菌被分成了37种CRISPRS型，以DCT24和DCT31为优势CRISPRS型。屠宰场共有185株细菌被分为18种CRISPRS型，其下游农贸市场共73株细菌被分为28种CRISPRS型，农贸市场菌株分型结果比屠宰场更具多样性。人源株德尔卑沙门菌CRISPRS型分别为DCT14、DCT20和DCT24型，间隔序列差异在5-14个之间，这三种CRISPRS型都包含屠宰场、农贸市场及人三种来源菌株，这表明德尔卑沙门菌可能在食物链中发生传播。对淮安某屠宰场猪肉源德尔卑沙门菌聚类比较分析结果显示30株德尔卑沙门菌被分为7种CRISPRS型，其之间的差异在1-9个间隔序列之间。三次样品菌株共享DCT24型，说明在该屠宰场长期存在此型的德尔卑沙门菌。来自同一个屠宰环节的菌株却属于不同的CRISPRS型，这说明在该屠宰场德尔卑沙门菌菌株存在来源多样化。在屠宰场同一批次不同环节中也存在相同的CRISPRS型，这说明了德尔卑沙门菌可能沿着屠宰链进行传播，因此每一屠宰环节都应做好卫生工作以防交叉污染。通过对9个地区猪场德尔卑沙门菌进行聚类分析，60株德尔卑沙门菌被分成11种CRISPRS型，其间隔序列差异在1-22个不等，以DCT24和DCT47为优势CRISPRS型。
　　综上显示CRISPRS分型方法能较好的将不同来源德尔卑沙门菌进行基因分型，并可根据间隔序列的种类、数量及分布位置来推测细菌的进化特点，更直观的看出菌株之间的差异。这在细菌分子流行病学调查中具有较高的应用价值。
　　2.德尔卑沙门菌R10和T12菌株生物学特性及全基因组测序分析研究
　　选取CRISRPS型谱系L1中的人源分离株R10，谱系L2中的猪肉源分离株T12进行生物学特性的研究。生化鉴定结果显示R10菌株的L-乳酸盐产碱(ILATK)为阴性，而T12菌株为阳性，其余生化指标均相同。R10菌株对四环素(TET)、复方新诺明(SXT)、链霉素(STR)、氯霉素(CHL)表现出耐药性，而T12菌株对所有测定抗生素均敏感。R10菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附力显著低于T12菌株(P＜0.05)，R10菌株侵袭力极显著低于T12菌株(P＜0.01)。R10菌株对猪空肠上皮细胞IPEC-J2的黏附和侵袭力均极显著低于T12菌株(P＜0.01)。以BALB/c小鼠为实验动物，测定两个菌株LD50，R10菌株LD50为1.17×107 CFU，T12菌株为2.64×107 CFU，二者在毒力上无显著性差异。
　　生物学特性研究显示出二者具有较大差异，因此对R10和T12菌株进行了全基因组测序分析。R10菌株基因组全长为4，881，181 bp，为环状结构，另有1个2834 bp的质粒，GC含量为52.0％，编码区GC含量为53.2％。对R10基因组注释结果发现有4678个蛋白编码基因，编码区占86.9％，另有107个结构RNA基因(85个tRNA，22个rRNA其中8个5S rRNA，7个16SrRNA，7个23S rRNA)。T12菌株基因组全长为4，920，869 bp，为环状结构，GC含量为52.1％，编码区GC含量为53.2％。对T12基因组注释有4755个蛋白编码基因，编码区占87.7％，另有106个结构RNA基因（84个tRNA，22个rRNA其中8个5S rRNA，7个16S rRNA，7个23SrRNA）。通过比对分析发现R10菌株基因组上存在一个新的毒力岛23(SPI-23)，约有36.4Kb，编码36个基因，而T12菌株基因组上只含有SPI-23末端1个相对保守的docB基因。通过对基因组耐药基因比对发现，R10菌株比T12菌株多了7个耐药基因，分别为aadA2，floR，FosA2，dfrA1，tetG以及两个sul1基因，分别为链霉素、氯霉素、磷霉素、磺胺类抗菌增效剂、四环素和复方新诺明耐药基因，这与R10和T12菌株的耐药表型相符合。基因组共线性分析显示，R10和T12菌株共有4个共线性模块(locallycolinear blocks，LCB)，而且基因组之间存在倒置现象（倒置区域有928 Kb），并且有部分插入或缺失，从基因组结构来看两株细菌差异较大。通过比较两株细菌核苷酸序列发现共有四万多碱基差异，此结果说明二者在基因组上有着巨大的差异，可能来自于不同的祖先。德尔卑沙门菌全基因组测序分析的完成为其生物学功能的深入研究及进化分析奠定了基础。

目录

摘要

符号说明

综述 德尔卑沙门菌的流行状况及分型方法研究进展

1．德尔卑沙门菌流行现状

2．德尔卑沙门菌基因组学研究

3．德尔卑沙门菌致病机制研究

参考文献

第一章 德尔卑沙门菌CRISPRS分子分型

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 德尔卑沙门菌R10和T12生物学特性及全基因组测序分析

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明