破骨细胞前体中VDR的激活对小鼠破骨细胞分化和活性的影响

摘要

破骨细胞(osteoclast，OC)是一种终末分化的多核巨细胞，来源于造血干细胞，在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)及核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)等多种细胞因子及激素的诱导下分化形成破骨细胞前体(osteoclast precursor，OCP)，进一步融合后形成破骨细胞。黏附在骨基质表面的破骨细胞被激活后发挥骨吸收功能。骨骼中破骨细胞数量及活性的异常与多种骨代谢性疾病的发生有关，如骨质疏松症、骨硬化症及风湿性关节炎等。破骨细胞前体表达多种受体蛋白，主要包括巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，c-fms)、核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor4，LGR4)等，多种受体的相互作用共同调控破骨细胞前体向破骨细胞的分化过程。
　　维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)是一种类固醇激素受体，主要分布在细胞核，细胞膜上也有少量分布。VDR参与多个系统及细胞的功能调控作用，包括代谢、免疫及发育等。小肠和肾脏中的VDR主要通过调控钙磷的重吸收来间接影响骨代谢过程，而骨组织中VDR的表达可以直接调控骨重建过程，参与调控破骨细胞的分化及骨吸收。成骨细胞(osteoblast，OB)及骨细胞(osteocyte)中VDR的表达主要通过促进RANKL的表达，同时抑制骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的分泌来调控破骨细胞的功能，而破骨细胞前体中VDR的表达对破骨细胞分化及骨吸收的影响尚不明确。本文旨在研究破骨细胞前体中VDR对破骨细胞分化及骨吸收功能的调控作用及机制，为揭示VDR调控骨代谢的分子机制提供科学依据。
　　1.小鼠破骨细胞体外分化模型的建立
　　体内破骨细胞存活时间短，数量少且分离困难。为获取大量具有骨吸收功能的破骨细胞，本文通过分离培养破骨细胞前体—骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophage，BMM)诱导分化形成破骨细胞，同时利用成骨细胞建立破骨细胞的共培养体系。
　　在破骨细胞直接诱导体系中，骨髓巨噬细胞按照1×104、2×104和5×104个/孔的细胞密度接种到96孔板中，同时添加30ng/ml M-CSF及50ng/ml RANKL进行诱导分化。结果表明，不同细胞接种密度下诱导4-5d后均可形成破骨细胞，但破骨细胞的分化效率随着骨髓巨噬细胞接种密度的升高而降低(P＜0.01)。在1×104个/孔的接种密度下，破骨细胞产生的数量最多，且骨吸收活性强。表明破骨细胞前体的细胞数量与破骨细胞的诱导分化效率存在一定关系。
　　在破骨细胞的共培养体系中，成骨细胞按照1×103个/孔的细胞密度接种到96孔板中，培养过夜后，将骨髓巨噬细胞按照上述细胞密度接种到预置有成骨细胞的96孔板中，同时加入前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)诱导分化。结果表明，成骨细胞与骨髓巨噬细胞共培养6-7d后，能诱导破骨细胞的形成，同时PGE2能够提高破骨细胞的分化效率。表明破骨细胞共培养体系的成功建立。
　　2.维生素D受体在小鼠破骨细胞分化过程中的表达分布
　　利用骨髓巨噬细胞诱导分化形成破骨细胞。通过RTCA检测破骨细胞分化过程中细胞增殖及活性的变化，免疫荧光染色观察VDR在破骨细胞前体及破骨细胞中的表达分布，RT-PCR检测破骨细胞分化过程中相关标志基因及VDR转录水平的变化，Western blot检测破骨细胞分化过程中关键转录因子NFATc1及VDR蛋白的表达。结果表明，破骨细胞前体及破骨细胞中均有VDR的表达，且VDR主要分布在细胞核中，少量分布在细胞膜上。VDR在破骨细胞分化过程中随着破骨细胞分化关键转录因子NFATc1及相关标志基因TRAP、CAII及MMP-9表达的升高而降低(P＜0.01)。表明破骨细胞前体中VDR的表达可能参与破骨细胞分化及骨吸收功能的调控。
　　3.破骨细胞前体中VDR的激活对小鼠破骨细胞分化的影响
　　添加VDR激活剂1α，25-(OH)2D3及VDR过表达病毒激活或过表达破骨细胞前体中VDR，同时利用M-CSF及RANKL诱导形成破骨细胞。利用RTCA检测VDR激活剂对破骨细胞前体细胞增殖及分化中细胞活性的影响，TRAP染色观察破骨细胞的形成数量，RT-PCR检测破骨细胞分化相关标志基因mRNA的表达，Western blot检测破骨细胞分化相关标志蛋白的表达。另外通过建立体外破骨细胞共培养模型，进一步明确破骨细胞前体中VDR对破骨细胞形成的影响。结果表明，VDR激活剂对破骨细胞前体的增殖无显著影响(P＞0.05)，破骨细胞前体中VDR激活或过表达后抑制破骨细胞的分化，且呈现一定的浓度-时间效应关系(P＜0.05)。同时破骨细胞前体中VDR激活或过表达后抑制破骨细胞相关标志基因TRAP、DC-STAMP及Integrinβ3的转录及翻译水平(P＜0.01)。在破骨细胞共培养模型中，破骨细胞前体中VDR过表达后，破骨细胞形成数量减少(P＜0.05)。表明破骨细胞前体中VDR的激活或过表达抑制破骨细胞分化。
　　4.破骨细胞前体中VDR的激活抑制小鼠破骨细胞分化的机制
　　在M-CSF及RANKL诱导破骨细胞分化过程中，添加VDR激活剂1α，25-(OH)2D3，通过Western blot检测破骨细胞分化早期信号及转录因子表达的影响;添加c-fos过表达病毒构建破骨细胞前体中c-fos基因的过表达模型，在此基础上激活VDR，TRAP染色观察破骨细胞的形成数量，RT-PCR检测破骨细胞分化相关标志基因的表达;添加基因转录及翻译的抑制剂，RT-PCR及Western blot检测破骨细胞前体中VDR激活后对转录因子c-fos mRNA及蛋白稳定性的影响;构建VDR及c-fos的标签融合表达载体，免疫共沉淀及免疫荧光法检测VDR及c-fos间的相互作用关系。结果表明，破骨细胞前体中VDR的激活对破骨细胞分化的早期信号MAPKs及Akt信号无显著影响（P＞0.05），而抑制关键转录因子c-fos及NFATc1的表达(P＜0.01)。破骨细胞前体中过表达c-fos后能消除或缓解VDR激活后引起的破骨细胞分化抑制作用(P＜0.01)。破骨细胞前体中VDR的激活降低c-fos的稳定性(P＜0.01)，且VDR与c-fos间存在相互作用关系。表明破骨细胞前体中VDR的激活能够与c-fos间产生相互作用，降低c-fos的稳定性，进而抑制c-fos及NFATc1的表达，最终抑制破骨细胞的分化。
　　5.破骨细胞前体中VDR的激活抑制小鼠破骨细胞骨吸收功能的机制
　　将破骨细胞前体培养在牛皮质骨片上，利用M-CSF及RANKL诱导形成破骨细胞，同时添加VDR激活剂1α，25-(OH)2D3。通过扫描电子显微镜观察破骨细胞骨吸收作用后形成的骨吸收陷窝，RT-PCR佥测破骨细胞骨吸收相关基因的表达，荧光显微镜观察破骨细胞多核化及细胞骨架的变化，Western blot检测Rho GTPases中关键调控蛋白RhoA、Rac1及Cdc42的表达变化。结果表明，破骨细胞前体中VDR的激活抑制了破骨细胞的骨吸收活性，降低相关功能蛋白CAII、CK及MMP-9的表达(P＜0.01)，同时抑制破骨细胞的多核化及细胞骨架F-actin环的形成，降低Rho GTPases中关键调控蛋白Rac1及Cdc42的表达(P＜0.01)，表明Rho GTPases中关键调控蛋白Rac1及Cdc42参与破骨细胞前体中VDR的激活对破骨细胞骨吸收活性的抑制作用。

目录

摘要

缩略语表

第一部分 文献综述

第一章 破骨细胞形成及骨吸收

1．破骨细胞简介

2．破骨细胞分化的信号转导机制

3 破骨细胞活化及调控机制

4．破骨细胞凋亡的研究

第二章 维生素D受体与骨代谢

1．维生素D受体的分子结构与功能

2．维生素D受体与骨代谢的研究

参考文献

第二部分 试验研究

第一章 小鼠破骨细胞体外分化模型的建立

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

参考文献

第二章 维生素D受体在小鼠破骨细胞分化过程中的表达分布

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

参考文献

第三章 破骨细胞前体中VDR的激活对小鼠破骨细胞分化的影响

1．实验材料与方法

2 结果

3．讨论

参考文献

第四章 破骨细胞前体中VDR的激活抑制小鼠破骨细胞分化的机制

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

参考文献

第五章 破骨细胞前体中VDR的激活抑制小鼠破骨细胞骨吸收功能的机制

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

参考文献

全文结论

致谢

攻读博士学位期间发表论文

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