MicroRNa-5112靶向IKKγ调控NF-κB炎性通路的功能研究

摘要

本实验室的前期研究发现mmu-microRNA-5112（miR-5112）在鞭毛蛋白活化小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的过程中表达水平下调，并初步发现其可通过靶向IKKγ参与鞭毛蛋白在TLR5/NF-κB通路中诱导炎性应答的调控。本研究进一步测定了miR-5112的表达规律，分别通过体内体外实验分析了miR-5112在鞭毛蛋白诱导炎性应答中的功能和机制;利用外源性agomiR-5112通过体内外实验探究了miR-5112对沙门菌诱导炎性反应的调节作用;同时通过小鼠模型测定了miR-5112对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的炎症性肠病的调节作用。
　　1.miR-5112调节鞭毛蛋白诱导的炎性应答的研究
　　通过体内外实验检测鞭毛蛋白活化脾脏DCs后miR-5112的表达情况。以100ng/mL鞭毛蛋白刺激磁分选获得的脾脏DCs，ELISA检测细胞上清中炎性因子的表达，结果显示鞭毛蛋白可以在体外诱导脾脏DCs分泌IL-6和IL-12p40;qRT-PCR检测miR-5112表达水平的结果显示鞭毛蛋白体外刺激脾脏DCs后miR-5112的表达水平明显下调。以2μg剂量的鞭毛蛋白腹腔免疫C3H/HeJ小鼠，磁分选获得脾脏DCs，qRT-PCR检测其炎性因子和miR-5112的表达水平，结果显示鞭毛蛋白免疫组小鼠脾脏DCs中炎性因子IL-6的表达水平上调，而miR-5112表达水平发生下调。以上结果表明鞭毛蛋白可以在体内外诱导下调脾脏DCs中miR-5112的表达。
　　qRT-PCR检测鞭毛蛋白刺激C3H/HeJ小鼠来源BMDCs后miR-5112表达的时间动态变化规律。结果显示鞭毛蛋白刺激BMDCs后miR-5112的表达水平先下调，然后又可恢复至正常水平。不同TLR配体Pam2CSK4（TLR2配体）、Poly(I∶C)（TLR3配体）、LPS(TLR4配体)、FliC（TLR5配体）、R848（TLR7配体）、CpG-ODNs（TLR9配体）作用于C57BL/6小鼠源的BMDCs，qRT-PCR检测miR-5112的表达情况。结果显示，除CpG-ODNs以外，其它5种TLR配体均可诱导BMDCs中miR-5112的表达水平下调1.5倍以上。qRT-PCR测定miR-5112在小鼠各脏器组织中的分布表达规律，结果显示小鼠各脏器和组织中均能检测到miR-5112的表达，但在不同脏器和组织中miR-5112的表达分布存在较大差异。以上结果表明miR-5112的表达具有一定的时间性和组织差异性，这可能与其发挥功能是相互适应的。
　　分别以不同的鞭毛蛋白突变体刺激小鼠BMDCs，结果显示89-96aa(TLR5识别位点)和460-494aa（NLRC4识别位点）缺失的鞭毛蛋白均不能诱导miR-5112表达水平的下调，只有同时具有TLR5和NLRC4活性的鞭毛蛋白才可诱导miR-5112表达水平的下调，表明TLR5信号通路和NLRC4信号通路对于miR-5112的下调表达是必需的。此外，野生型鞭毛蛋白刺激MyD88基因缺失小鼠来源的BMDCs，并不能诱导其miR-5112表达水平发生变化，这进一步表明miR-5112的下调需要TLR5和NLRC4信号通路的参与。
　　miR-5112mimics转染BMDCs后，检测miR-5112对鞭毛蛋白诱导炎性因子表达水平的影响。结果显示，转染miR-5112mimics的BMDCs经鞭毛蛋白刺激后，炎性因子IL-12p40的表达水平明显降低，表明miR-5112可以抑制鞭毛蛋白诱导的炎性应答。Western Blotting检测BMDCs中炎性信号分子的表达，结果显示miR-5112mimics可以显著抑制其靶标分子IKKγ的表达，同时miR-5112mimics转染组中NF-κB P65的磷酸化水平也明显下调，表明miR-5112可以通过调节IKKγ的表达抑制NF-κB通路炎性因子的表达。
　　利用agomiR-5112（模拟物）和antagomiR-5112（抑制物）评价miR-5112在小鼠体内对鞭毛蛋白诱导炎性应答的调节作用。agomiR-5112和antagomiR-5112腹腔注射小鼠24h后，分别腹腔免疫鞭毛蛋白，然后利用ELISA和CBA检测小鼠血清中炎性因子的变化。结果显示agomiR-5112可以明显减少鞭毛蛋白诱导小鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-10含量的增加;而antagomiR-5112则可增加鞭毛蛋白诱导的炎性因子IL-6、TNF-α、IL-12p40、MCP-1、IL-10的含量;表明miR-5112可以在小鼠体内调节鞭毛蛋白诱导的炎性应答。
　　2.miR-5112调控沙门菌诱导的炎性应答的研究
　　利用小鼠腹腔巨噬细胞建立肠炎沙门菌感染的体外模型，评价miR-5112对沙门菌诱导的炎性应答的调节作用。结果显示，agomiR-5112转染小鼠腹腔巨噬细胞后可明显增加细胞中miR-5112的含量。agomiR-5112转染组腹腔巨噬细胞经沙门菌感染后，其炎性因子IL-6的分泌水平显著低于单独的沙门菌感染组，表明miR-5112可以体外调节沙门菌诱导的炎性应答。
　　利用链霉素预处理的小鼠建立沙门菌感染的体内模型，评价miR-5112在体内对沙门菌诱导的炎性应答的调节作用。Luminex检测沙门菌感染后小鼠血清中细胞因子的变化，沙门菌感染小鼠8h时，在各感染组的小鼠血清中均未能检测到明显的细胞因子变化，表明肠炎沙门菌感染早期不能诱导小鼠血清中细胞因子含量的增加。沙门菌感染4d时，在各沙门菌感染组的小鼠血清中均可以检测到明显的细胞因子变化，且腹腔注射agomiR-5112可以明显降低血清中沙门菌诱导的细胞因子的增加，包括IL-1β、IL-12p40、IL-6、TNF-α和IP-10。病理分析结果显示，肠炎沙门菌感染8h和4d时，小鼠肝脏和盲肠组织中均有炎性细胞浸润现象，但是注射agomiR-5112后的沙门菌感染组小鼠脏器的炎性细胞聚集现象明显减少，表现出轻微炎症，病理损伤较小。以上结果表明了miR-5112可以在体内抑制沙门菌诱导的炎性反应。沙门菌感染后各脏器的定植结果显示，在沙门菌感染8h时，agomiR-5112注射组小鼠的肠道组织（结肠、回肠和盲肠）中沙门菌的定植数明显少于单独的沙门菌感染组，表明miR-5112可以抑制沙门菌在小鼠体内的定植。小鼠的体重监测结果显示，agomiR-5112可以明显减少沙门菌诱导的小鼠体重降低程度，同时小鼠的存活曲线显示注射agomiR-5112后的沙门菌感染组小鼠的存活时间长于单独的肠炎沙门菌感染组，表明agomiR-5112可以一定程度的延缓沙门菌诱导的死亡。以上结果表明miR-5112可作为重要的调节因子参与宿主的炎性应答与抗菌感染。
　　3.miR-5112调节DSS诱导的结肠炎的研究
　　建立DSS诱导的小鼠结肠炎模型，使用外源性agomiR-5112评价miR-5112对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。小鼠自由饮用4％DSS后出现了食欲减退、精神萎靡、形体消瘦、活动减少、皮毛凌乱无光泽等症状，随着时间的推移小鼠开始出现稀水样粪便和便血情况，表现出典型的结肠炎症状，表明成功地建立了小鼠的结肠炎模型。小鼠自由饮用DSS后第3d和第6d血清中炎性因子检测结果显示，小鼠饮用DSS后血清中炎性因子IL-6的含量增加，且agomiR-5112可以明显抑制DSS诱导的血清中炎性因子IL-6含量的增加，表明miR-5112可以降低DSS诱导的系统性炎症。饮用DSS6d后，利用ELISA测定结肠组织中炎性因子的变化，结果显示，小鼠结肠组织中的炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1的表达量增加，且注射agomiR-5112可以抑制结肠组织中IL-6、TNF-α和MCP-1的增加。MPO是中性粒细胞特征性酶，可作为炎性反应的标志，结肠组织中MPO的测定结果显示注射agomiR-5112可以抑制DSS诱导的MPO含量的增加。结肠组织的病理分析结果显示，与单独的DSS处理组小鼠相比，注射agomiR-5112可以明显减少结肠组织中炎性细胞浸润、减轻对结肠组织结构的破坏程度。结肠组织的长度缩短是反映DSS诱导结肠炎炎性强弱的一个重要指标，其测定结果显示agomiR-5112可减少DSS诱导的结肠长度的缩短。以上结果均表明agomiR-5112可以抑制DSS诱导的结肠炎小鼠的炎症反应。疾病活动指数DAI的评分结果显示，小鼠自由饮用DSS后，随着时间的推移，DAI评分显著升高，表明小鼠结肠炎的临床病症逐渐加重;腹腔注射agomiR-5112可以明显降低小鼠结肠炎的DAI评分，表明agomiR-5112可以减缓结肠炎发展的临床表征。以上研究结果表明miR-5112可以参与调节DSS诱导的结肠炎，抑制DSS诱导的炎性反应，减缓DSS诱导的结肠炎的临床病症。该结果也暗示着miR-5112具有成为治疗炎症性肠病靶点和药物的潜力。

目录

摘要

符号说明

综述 MicroRNA调节机体免疫应答的研究进展

1 miRNA的产生及功能

2 miRNA调节免疫系统的发育

3 miRNA与天然免疫应答

4 miRNA与获得性免疫

5 miRNA与炎性疾病

6 展望

第一章 miR-5112调节鞭毛蛋白诱导的炎性应答的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 miR-5112调控沙门菌诱导的炎性应答的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 miR-5112调节DSS诱导的结肠炎的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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