江苏省牛常见呼吸道病毒病流行病学调查及表达BVDV-2 E2基因重组BHV-1疫苗的免疫效果评价

摘要

牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)是由病毒、细菌等多种病原体和应激等多因素协同作用而引起牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease，BRD)的通称，可引起牛发热、食欲下降、精神沉郁、眼鼻流分泌物，咳嗽、不同程度呼吸困难等。研究证明，引起BRDC主要有牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒1型(BHV-1)、牛副流感病毒3型（BPIV-3）以及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)。这些病毒单独感染时可造成牛呼吸道黏膜的损伤，出现温和临床症状，但当它们与细菌或其它病毒混合感染时，可引起牛出现严重的临床症状，甚至死亡。BRDC在全世界范围内发病流行，目前我国绝大部分省份都有该病的流行报道。BRDC每年给全球造成的损失高达数十亿美元，成为影响和制约全球养牛业健康发展的主要障碍。科学的饲养管理和疫苗注射是防控BRDC的关健，但国内目前尚缺少有效的疫苗。本研究基于对目前江苏地区牛呼吸道常见病毒病的流行情况展开调研，并通过对构建的表达BVDV-2E2基因的BHV-1重组病毒候选疫苗在牛体上进行了初步免疫效果评估，为本病的免疫防控提供试验数据和科学参考。
　　研究一:采用商品化BHV-1和BVDV抗体ELISA检测试剂盒对来自江苏省7个地区的13个大型规模化奶牛养殖场进行BHV-1和BVDV血清抗体检测，同时使用巢式RT-PCR方法进行BVDV抗原检测与基因分型。结果表明不同牛场的BHV-1抗体阳性率在0％～82.1％之间，平均阳性率为21.1％;不同牛场的BVDV抗体阳性率在0％～98％之间，平均阳性率为51.5％;不同牛场的BVDV抗原阳性率在0％～100％之间，平均阳性率为55％;不同基因型BVDV检测结果表明，BVDV-1型占11％、BVDV-2型占78％，两者混合感染占11％。调研检测中未发现BVDV-3型。研究表明，BVDV和BHV-1已在江苏省主要规模奶牛场普遍存在与流行。
　　研究二:基于BHV-1gB基因序列设计了两对PCR引物，建立了检测BHV-1的巢式PCR技术，并对PCR扩增体系与反应条件进行了优化，同时进行了敏感性和特异性检测。结果表明，这两对引物均能扩增出预期大小的gB条带，分别为350bp和250bp;将提取的病毒DNA连续10倍稀释，最高可检测出10-6稀释浓度，即最低检测限为0.44pg BHV-1DNA;巢式PCR(nPCR)的敏感性是单轮PCR的10000倍。应用该nPCR方法对20份公牛精液进行直接检测，结果其中有2份样品成功扩增出预期大小的阳性条带，将测序结果上传GenBank数据库中进行BLAST分析，结果显示与BHV-1序列高度同源。试验结果表明，相比较传统病毒分离方法，该nPCR更为敏感和便捷，适于BHV-1病原快速检测与临床疾病诊断。
　　研究三:采集扬州和淮安两个屠宰场76份牛病肺样本，应用PCR/RT-PCR方法检测牛肺组织中的BHV-1、BVDV、BRSV、BPW-3、牛腺病毒(BAV)和牛冠状病毒(BCV)的带毒感染情况。结果共检测出阳性样本44例，总阳性率为58％，其中BHV-1感染率最高，占25％，BVDV次之，为19.7％，BRSV为13.2％，未检测出有BPIV-3、BAV和BCV感染;存在两种病毒混合，感染率为18％;黄牛中病毒感染率略低于奶牛。结果表明，BHV-1、BVDV和BRSV可能是江苏地区黄牛与奶牛BRDC的主要病毒病原体，部分牛出现多种病毒混合感染现象，上述调研数据预警出今后BRDC的防控难度。
　　研究四:9头6-8月龄的BVDV和BHV-1抗原及抗体阴性荷斯坦公牛被随机分成三组，分别免疫接种正常剂量(2mL)、加倍免疫剂量(4mL)的v41B(表达BVDV-2E2基因重组BHV-1病毒)重组病毒候选疫苗和对照DMEM培养基(2mL)，四周后再重复免疫一次，同时进行疫苗安全性试验、血清抗体检测及攻毒保护试验。结果显示，在两次免疫接种后，实验牛均未见明显临床反应;初次免疫后第一周就能从血清中检测出抗BHV-1中和抗体或ELISA抗体，第二周能从血清中检测出抗BVDV ELISA抗体，而从加强免疫后第1周起，两者的抗体水平均迅速升高，到第八周时BHV-1中和抗体滴度达到1∶64以上，BVDV血清ELISA抗体OD450在1.5以上，并维持较高水平至实验结束（13周），而正常疫苗剂量组与加倍疫苗剂量组所产生的抗体滴度差异不显著;攻毒保护实验结果表明，免疫组牛出现病毒血症，在临床症状、体温、白细胞减少等各方面均显著低于未免疫对照组。结果初步表明该重组病毒载体疫苗能够同时刺激机体产生较高水平的抗BVDV-2和BHV-1抗体，具有良好的安全性与免疫效果，这为今后该疫苗大规模临床试验与潜在应用奠定了基础。

目录

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

一、牛病毒性腹泻病毒概述

1．1 病原特性

1．2 基因分型

1．3 致病机理

1．4 临床症状与病理变化

1．5 流行病学

1．6 疫苗研究进展

二、牛传染性鼻气管炎病毒概述

2．1 病原特性

2．2 基因分型

2．3 流行病学

2．4 致病机理

2．5 临床症状

2．6 BHV-1疫苗研究进展

三、牛呼吸道合胞体病毒概述

3．1 病原特征

3．2 病原分型

3．3 流行病学

3．4 症状与病变

3．5 预防及控制

四、牛副流感病毒3型概述

4．1 病原特征

4．2 流行病学

4．3 症状与病变

4．4 预防及控制

第二章 江苏省规模化奶牛场奶牛BVD与IBR感染的流行病学调查

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 仪器与设备

1．3 样品来源

1．4 血清抗体ELISA检测

1．5 BVDV病原检测与基因分型

1．6 BVDV抗原与抗体检测结果分析

1．7 数据统计与分析

2 结果

2．1 江苏省奶牛感染BHV-1血清学调查结果

2．2 江苏省不同地区奶牛感染BHV-1血清抗体阳性率

2．3 江苏省奶牛感染BVDV血清学调查结果

2．4 江苏省不同地区奶牛感染BVDV血清抗体阳性率

2．5 江苏地区奶牛感染BVDV分子流行病学调查结果

3 讨论

第三章 牛传染性鼻气管炎病毒巢式PCR检测方法的建立及临床初步应用

1 材料与方法

1．3 引物设计

1．4 病毒DNA的提取

1．5 DNA浓度的测定

1．6 PCR方法的初步建立

1．7 退火温度的优化

1．8 引物浓度的优化

1．9 PCR敏感性试验

1．10 PCR反应特异性测定

1．11 临床样品的检测

2 结果

2．1 PCR初步扩增结果

2．2 退火温度优化结果

2．3 引物浓度优化结果

2．4 PCR反应敏感性测定结果

2．5 PCR的特异性

2．6 PCR最佳反应体系和条件结果

2．7 临床样品初步检测结果

3 讨论

第四章 屠宰牛常见呼吸道病毒的分子流行病学调查

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

1．2 样本来源

1．3 引物设计

1．4 样品处理

1．5 病毒基因组DNA

1．6 病毒RNA的提取

1．7 cDNA转录

1．8 PCR反应体系

1．9 PCR扩增

1．10 电泳成像

1．11 PCR产物的纯化

1．12 PCR产物的克隆和测序

1．13 序列同源性分析及系统发育进化树比较

2 结果

2．1 PCR扩增结果

2．2 基因测序及序列比较结果

2．3 病原检测统计结果

2．4 混合感染统计结果

3 讨论

第五章 表达BVDV-2 E2基因的重组BHV-1病毒在牛体上的安全性与免疫效果评估

1 材料与方法

1．2 主要试剂和仪器

1．3 实验动物

1．4 病毒的增殖和TCID50的测定

1．5 免疫程序的制定

1．6 免疫牛的临床检查

1．7 免疫后实验牛的实验室检查

1．8 攻毒保护试验

1．9 数据处理

2 结果

2．1 病毒的TCID50测定结果

2．2 免疫后实验牛临床症状检查结果

2．5 免疫后实验牛实验室检查结果

2．6 攻毒保护实验结果

3．讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文、申请专利及专著

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