Itpr1基因突变引起小鼠瞳孔散大及其分子机制研究

摘要

乙烷基亚硝基脲(ENU)是目前公认的最有效的小鼠诱变剂之一。利用ENU可以在短期内获得大量突变小鼠从而建立人类疾病的小鼠模型进而用于相关疾病发生机制的研究。本文在ENU诱变获得一例瞳孔散大小鼠Dp2(Dilated pupil mutation2)模型基础上，成功定位与鉴定引起该表型的突变基因并对该表型发生原因进行研究分析。现汇报如下:
　　1、ENU诱变获得Dp2瞳孔散大小鼠模型
　　通过注射ENU诱导小鼠突变手段，获一例大瞳孔杂合子小鼠Dp2，当用光照射小鼠眼球时瞳孔无明显缩小。本文以此大瞳孔小鼠为研究对象，将该小鼠与野生型B6小鼠配种，观察并记录770只后代，其中359只小鼠具有大瞳孔表型，且该表型在小鼠4周龄(4W)左右恢复。组织学分析Dp2小鼠眼球发现，小鼠虹膜未见明显缺损。毛果芸香碱不能使该表型小鼠瞳孔缩小。以上结果显示:Dp2小鼠大瞳孔表型是由瞳孔括约肌收缩缺陷引起的瞳孔散大。
　　2、Dp2小鼠突变基因的定位与鉴定
　　将B6背景瞳孔散大杂合子小鼠与野生型D2小鼠配种获得F1代瞳孔散大小鼠，F1代小鼠回交B6获得[(B6×D2)×B6]N2代小鼠，筛选出具有瞳孔散大表型的N2代小鼠用于突变基因的定位。基因连锁分析显示:突变基因与微卫星D6Mit230连锁（LOD值12.92），初步将该基因定位于小鼠第6号染色体上。为对该突变基因进行精确定位，增加N2代小鼠数量并在小鼠第6号染色体上增加微卫星密度。最终，突变基因被确定在D6Mit149和D6Mit148之间，即遗传距离48.93cM-51.53cM之间。
　　在精确定位区间，MGI数据库报道有10个蛋白编码基因(Arl8b、Bhlhe40、Crbn、Edem1、Il5ra、Itpr1、Lrrn1、Setmar、Sumf1、Trnt1)和两个未分类的非编码RNA基因（0610040F04Rik、Gm17055）。对以上基因序列进行测序对比后发现，除Itpr1基因外，其他基因未发现突变。对Itpr1基因编码区测序发现，该基因编码区第5927位核苷酸发生由G到A的转换，蛋白预测发现，该突变可引起其编码蛋白IP3R1第1976位氨基酸由半胱氨酸转变为酪氨酸。
　　3、Dp2瞳孔散大机制的研究
　　以Anti-IP3R1、Anti-Myosin light chain(phospho S20)及Anti-GRP78BIP抗体为一抗，采过免疫组织化学技术对未恢复(2W)和恢复(4W)的Dp2小鼠及同窝野生型小鼠瞳孔括约肌进行分析，结果发现:与野生型小鼠相比Dp2小鼠IP3R1水平未见明显差异，Itpr1基因的突变不影响IP3R1蛋白的表达;未恢复(2W)Dp2小鼠Myosin light chain的磷酸化水平明显低于野生型小鼠，平滑肌收缩活动受到抑制，恢复(4W)的Dp2小鼠Myosin light chain的磷酸化水平与野生型小鼠未见明显差异，平滑肌收缩能力恢复正常水平;未恢复(2W)Dp2小鼠BIP水平明显高于野生型小鼠，此时存在未折叠蛋白反应，恢复(4W)的Dp2小鼠BIP水平与野生型小鼠未见明显差异。
　　结论:本文使用ENU诱变获得一例瞳孔散大小鼠，基因定位及鉴定发现该表型是由Itpr1突变引起。进一步研究结果显示Itpr1突变可引起内质网未折叠蛋白反应，使得部分IP3R1蛋白功能暂时性丧失，导致瞳孔括约肌收缩障碍，从而引起小鼠临时性瞳孔散大表型。

目录

摘要

符号说明

文献综述：三磷酸肌醇受体研究进展

1．1 IP3R1

1．2 IP3R2

1．3 IP3R3

2．1 Gillespie综合征(GS)

2．2 亨廷顿病

3 结语

实验部分

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 Dp2小鼠突变基因的定位与鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 Dp2小鼠瞳孔散大机制的研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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