2016-2017年我国部分地区NDV病原学监测及两种快速检测方法的建立

摘要

新城疫是由新城疫病毒强毒株感染引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，对世界范围内的禽类养殖业危害极大。目前尽管本病在我国已经得到了有效控制，但病原体仍存在于一些地区，并且近年有新基因型新城疫病毒的出现，为了解病原体的分布和病原学特征，进一步防控和消灭本病，本研究对部分地区的病原进行了监测和遗传演化分析，建立了两种能够快速鉴别新城疫强毒株的方法，对分离到的流行毒株进行了检测。
　　1.2016-2017年我国部分地区新城疫病毒病原学监测
　　2016-2017年在我国部分地区开展了新城疫流行病学调查与病原学分析。共收集3647份样品，分离到62株新城疫病毒。2016年分离到了46株新城疫病毒，27株来自鸡、14株来自鸭、4株来自鹅、1株来自鸽;2017年分离到16株新城疫病毒，11株来自鸡、3株来自环境样品、2株来自鸽。
　　对F基因部分片段测序后进行遗传演化分析，结果表明:62株新城疫病毒分离株中有39株属于Ⅰ类3型、13株属于Ⅱ类Ⅱ型、3株属于Ⅱ类基因Ⅵ型、1株为Ⅱ类基因Ⅶ型、6株NDV为国内新出现的Ⅰ类的未确定基因型病毒。Ⅰ类基因3型和Ⅱ类Ⅱ型NDV为2016-2017年我国这些地区的优势基因型。为进一步了解新基因型毒株及部分地区NDV优势基因型毒株的病原学特征，选取了1株Ⅰ类基因3型、1株Ⅱ类基因Ⅱ型、4株新基因型分离株进行了F基因扩增与同源性分析，同源性分析结果显示Ⅰ类3型毒株与我国3型分离株同源性较高、Ⅱ类Ⅱ型分离株与La Sota同源性为99.9％、4株新基因毒株同源性高于97.9％。4株新基因型毒株的F蛋白裂解位点均为112E-R-Q-E-R-L117符合新城疫病毒弱毒的裂解位点序列，均有12个半胱氨酸和6个糖基化位点，与其他Ⅰ类新城疫病毒的F蛋白功能区比较均未出现蛋白替换。利用F基因高变区建立系统进化树结果显示:这4株毒株与Ⅰ类1-10型的bootstrap＜75，遗传关系较远，不能归属为Ⅰ类1-10型，为Ⅰ类新基因分型毒株，利用F基因编码区全长序列构建系统进化树发现这4株毒均属于基因1c亚型，与北美分离株同源关系更近。为进一步了解我国新基因型毒株的基因组特征，选取了宁夏分离株duck/Ningxia/2209/2016（以下简称为NX2209）进行基因组扩增，基因组全长为15198nt，同源性分析结果显示，NX2209属于Ⅰ类新城疫病毒。
　　2.新城疫病毒强弱毒双重RT-PCR方法的建立及应用
　　分别设计了1对强毒和1对弱毒的引物，建立了可区分NDV强毒和弱毒的一步法双重RT-PCR方法，对新城疫病毒强毒可以扩增出353bp和228bp的双条带，弱毒仅可以扩增出一条353bp的单条带。灵敏性试验和特异性试验结果表明，该方法可检测到的最低核酸拷贝数为1.1×105和1.7×105，能够检测到的最低RNA的浓度为0.02pg/μL;使用9种临床常见的禽类病毒（禽流感病毒（H5亚型、H7亚型、H9亚型）、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡减蛋下降综合征病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽网状内皮组织增生症病毒）进行扩增均未出现特异性条带;使用该双重RT-PCR与本实验室以前建立的快速鉴别Ⅰ类和Ⅱ类新城疫病毒的多重RT-PCR方法、国标中鉴定NDV的方法对2017年718份临床样品进行平行试验对照，该方法的诊断方法敏感性为98.36％，特异性为97.0％，优于另外2种方法。测序结果显示，本研究建立的双重RT-PCR方法阳性符合率为90.54％。
　　3.新城疫强毒NASBA检测方法的建立及应用
　　通过引物筛选和条件优化成功建立了新城疫强毒的NASBA检测方法，灵敏性试验表明能够检出的核酸最低为5个拷贝数，此时RNA的浓度为7.24×10-7pg/μL;特异性试验表明该方法对7株禽类常见的病毒（H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒）未扩增出特异性条带;选取53份样品使用NASBA方法和新城疫病毒强弱毒双重RT-PCR方法进行平行试验比较，该方法的诊断方法敏感性为97.22％，特异性为94.11％，优于RT-PCR方法。测序结果显示，NASBA的阳性符合率为97.22％，优于RT-PCR方法。

目录

摘要

符号说明

综述

1 病原学

2 新城疫病毒结构蛋白特点及功能

3 NDV的毒力分型及致病性分子基础

4 NDV诊断方法

5 新城疫在我国的流行现状

6 NASBA技术

第一章 2016-2017年我国部分地区新城疫病毒病原学监测

1 材料

2 方法

2．1 病毒分离和鉴定

2．2 F基因全长的扩增、序列分析和遗传进化

2．3 新基因型毒株基因组扩增和分析

3 结果

4 讨论

第二章 新城疫病毒强弱毒快速鉴定双重RT-PCR方法的建立及应用

1 材料

2 方法

2．1 毒株的准备

2．2 NDV强弱毒引物的设计与筛选

2．3 反应条件的优化

2．4 标准品的建立

2．5 NDV强弱毒双重RT-PCR分析方法性能特点

2．6 NDV强弱毒双重RT-PCR方法的应用及诊断方法特性分析

3．结果

4 讨论

第三章 NASBA检测NDV强毒方法的建立及应用

1 材料

2 方法

2．1 RNA的提取

2．2 NASBA引物的设计

2．3 NASBA方法的建立

2．4 NASBA反应条件的优化

2．5 NASBA快速检测NDV强毒株方法评价试验

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

附录

攻读硕士论文期间发表的论文

致谢

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