银杏外种皮提取物抑制B16-F10黑色素瘤转移及其对PI3K/Akt相关信号通路的影响

摘要

目的:
　　研究银杏外种皮提取物（Ginkgo biloba exocarp extracts，GBEE）体内外抗B16-F10黑色素瘤转移作用及相关机制。
　　方法:
　　建立C57BL/6J小鼠B16-F10黑色素瘤肺转移模型，将C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组（不接种肿瘤细胞）、模型对照组、阳性对照组、GBEE各治疗组，每组10只。正常对照组和模型对照组灌胃(ig)给予0.1mL/10g生理盐水(NS)，每天1次，连续17d;阳性对照组隔日腹腔注射(ip)给予5mg/kg顺铂(DDP)，连续7d;GBEE各治疗组分别ig给予GBEE50、100、200mg/kg，每天1次，连续17d。给药结束后第2天，剥瘤称量移植瘤重量，计算抑瘤率;摘取肺组织，于解剖显微镜下观察肺转移灶，计算肺转移率和抗转移率;制备肺组织和移植瘤组织切片，苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化;免疫组织化学法检测移植瘤组织CD34的表达并计算微血管密度(MVD)，同时检测HIF-1α、VEGF、MMP-9的表达水平。体外培养B16-F10细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，采用MTT比色法检测GBEE对B16-F10细胞体外增殖的影响;通过细胞黏附实验观察GBEE对B16-F10细胞与HUVEC异质黏附作用的影响;采用细胞划痕法检测GBEE对B16-F10细胞迁移的影响。采用qRT-PCR法和Western Blot法检测GBEE在体内外对HIF-1α、VEGF、VEGFR2、NF-κB、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达水平的影响。
　　结果:
　　体内实验结果显示，GBEE(50、100、200mg/kg)可抑制B16-F10黑色素瘤移植瘤生长和肺转移，使移植瘤组织MMP-9表达减少，并抑制CD34表达、使MVD降低，且效应皆具有剂量依赖性;同时，可抑制B16-F10移植瘤组织HIF-1α、VEGF和VEGFR2mRNA和蛋白表达，且其抑制作用具有量效关系;还可使B16-F10移植瘤组织p-PI3K、p-Akt的蛋白表达水平呈剂量依赖性降低，但对PI3K、Akt总蛋白表达水平无明显影响。体外实验结果表明，在5-320μg/mL浓度范围内，GBEE可显著抑制B16-F10细胞增殖，且随着药物浓度的增加其抑制率呈增长趋势;GBEE(10、20、40μg/mL)呈浓度依赖性抑制B16-F10细胞迁移及B16-F10细胞与HUVEC的异质黏附;在mRNA和蛋白水平，GBEE(10、20、40μg/mL)对B16-F10细胞NF-κB、MMP-9、p-PI3K、p-Akt的表达具有抑制作用，并呈浓度依赖效应，但对PI3K、Akt表达无明显影响。
　　结论:
　　GBEE抗B16-F10黑色素瘤转移的作用机制可能涉及影响PI3K/Akt/NF-κB/MMP-9信号通路而抑制肿瘤细胞增殖、迁移、异质黏附、细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)降解以及干预PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF信号通路而抑制血管生成。

目录

摘要

符号说明

0 前言

1 综述

2 技术路线

3 实验材料

3．1 银杏外种皮提取物

3．2 细胞和动物

3．3 主要仪器

3．4 主要药品与试剂

3．5 主要溶液配制

4 实验方法

4．4 免疫组织化学法检测B16-F10移植瘤中CD34，MMP-9，HIF-1α，VEGF表达

4．6 细胞黏附实验观察B16-F10细胞与HUVEC异质黏附

4．9 qRT-PCR法检测B16-F10细胞和移植瘤组织相关基因表达

4．10 数据统计方法

5 实验结果

5．3 GBEE对B16-F10移植瘤MMP-9的影响

5．5 GBEE对B16-F10移植瘤中PI3K／Akt／HIF-1α／VEGF信号通路的影响

5．6 GBEE对B16-F10细胞增殖的抑制作用

5．8 GBEE对B16-F10细胞迁移的抑制作用

5．9 GBEE对B16-F10细胞中PI3K／Akt／NF-κB／MMP-9信号通路的影响

6 讨论

6．2 GBEE对PI3K／Akt相关信号通路的调控作用

创新点

结语

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及科研情况

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