pcDNA3.0-hVEGF165的构建及转染大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外研究

摘要

目的： 构建人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)真核表达质粒：pcDNA3.0-hVEGFl65，并探讨pcDNA3.0-hVEGF165转染大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞(EPC)的体外基础研究。 方法： 设计引物后，ECV304细胞提取总RNA，经逆转录(reverse transcription)得到cDNA，经PCR得到目的基因扩增片段，将其连接入pcDNh3.0空质粒载体中，构建人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)真核表达质粒：pcDNA3.0-hVEGF165。对重组质粒进行PCR、双酶切及测序鉴定。EGM-2MV培养基培养大鼠骨髓单个核细胞富集EPC，脂质体介导pcDNA3.0-hVEGFl65转染EPC，ELISA法检测转染后上清中VEGF蛋白水平，ECV304细胞生长刺激实验评价转染后上清中VEGF蛋白的活性，MTT法评价pcDNA3.0-hVEGF165转染对EPC活性的影响，免疫细胞化学检测转染后EPC表达VEGF、vWF、VEGFR-2(FLK-1)的变化。 结果： 成功构建了人血管内皮细胞生长因子165(hVEGFl65)真核表达质粒：pcDNA3.0-hVEGF165。应用EGM-2MV培养基培养大鼠骨髓单个核细胞能很好的富集EPC，获得的EPC能表达CD34、CD133、FLK-1等特征性的细胞表面标志，脂质体介导pcDNA3.0-hVEGF转染EPC能表达一定浓度的VEGF蛋白，每24小时分泌浓度于第四天到达峰值，后渐降低。且分泌的蛋白能刺激ECV304细胞的生长，转染对EPC的增殖无影响，并能帮助EPC细胞保持内皮细胞系的特性，转染后七天内表达VEGF、vWF、VEGFR-2(FLK-1)的比率随时间而逐渐升高。 结论： 成功构建了人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)真核表达质粒：pcDNA3.0-hVEGFl65。脂质体介导pcDNA3.0-hVEGF165转染EPC后能表达一定浓度的有功能的VEGF蛋白，对EPC的增殖无影响，并能帮助EPC保持内皮细胞系细胞的特性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

附 图

综 述 血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的研究进展

常用试剂的配置

攻读学位期间公开发表的论文

致 谢