IL-31在皮肤炎症中的作用及作用机制研究

摘要

目的：克隆人IL—31基因、构建原核及真核表达载体，在大肠杆菌及哺乳动物细胞中表达，纯化IL—31蛋白，研究其在皮肤炎症中的作用及作用机制。 方法：PMA、PHA刺激正常人外周血单个核细胞，提取细胞总RNA，采用RT—PCR克隆人IL—31基因，将其克隆到原核表达载体pET28a（+），通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达；同时将其克隆到真核表达载体pcDNA3．1/myc—His（—）A，将重组质粒转染CHO细胞，用RT—PCR和western—blot分析rhIL—31在CHO细胞中的表达。Ni树脂纯化在原核及真核细胞表达的his融合蛋白；用不同剂量rhIL—31刺激人表皮角质细胞HaCaT，利用transwell穿孔板检测HaCaT细胞培养上清对外周血单个核细胞的趋化作用，RT—PCR、荧光定量PCR检测巨噬细胞炎性蛋白—3β（MIP—3β）、胸腺和活化调节趋化因子（TARC）、巨噬细胞来源的趋化因子（MDC）及T细胞活化蛋白—3（TCA—3/1—309）的表达，western—blot检测STAT1、STAT3、STAT5磷酸化；小鼠皮内注射该目的蛋白，观察局部炎症表现，皮肤标本HE染色观察皮肤炎性特征，小鼠外周血白细胞计数及分类，ELISA法检测血清细胞因子IL—1β、IL—6和TNF—α水平，流式细胞仪分析胸腺及脾脏T淋巴细胞亚群。 结果：成功获得495bp的全长人IL—31基因，测序正确，经双酶切、PCR和序列测定鉴定，原核表达质粒构建正确，IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达；真核表达质粒构建正确，可在CHO细胞中表达。该目的蛋白可刺激人表皮角质细胞HaCaT表达趋化因子MIP—3β、TARC、MDC及I—309，HaCaT细胞培养上清对人外周血单个核细胞有趋化作用，在rhIL—31刺激后，HaCaT细胞STAT1、STAT3、STAT5磷酸化增加；小鼠皮肤注射部位有脱毛，皮肤标本HE染色可见炎性细胞浸润，小鼠外周血白细胞总数增加，中性粒细胞比例增高，血清11—1β、IL—6和TNF—α水平增高，脾脏CD4+T细胞占T细胞总数的百分比增高，CD8+T细胞亚群占T细胞总数的百分比减少。 结论：成功克隆hIL—31基因，并构建了hIL—31原核及真核表达载体；应用Ni树脂对原核及真核表达的蛋白进行纯化，获得了高纯度的IL—31蛋白；皮内注射IL—31可诱导BALB/c小鼠皮肤炎症，局部炎性细胞浸润，血清炎性细胞因子表达水平增高，脾脏CD4+T细胞比例增高；IL—31可诱导表皮角质细胞表达趋化因子MIP—3β、MDC、TARC和I—309，细胞培养上清对外周血淋巴细胞有趋化作用；IL—31可通过STAT途径转导信号。

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论文说明：缩略词语

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引 言

第一部分 hIL-31基因克隆、在原核细胞中的表达及多克抗体的制备

第二部分 IL-31诱导小鼠皮肤炎症

第三部分 IL-31对人表皮角质细胞的作用

第四部分 hIL-31在真核细胞中的表达及对人表皮角质细胞的作用

结 论

综 述：炎性白细胞介素研究进展

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