罗氏沼虾白斑综合症病毒基因组5个未知功能区域的研究

摘要

对虾白斑综合症是对虾养殖业中危害最严重的一种传染性疾病，其病原是白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)。目前，对WSSV的病原学、流行病学、诊断学、感染机理等研究已经深入到分子水平。WSSV基因组全序列在GenBank上已公布三个版本。其基因组学的研究重点正转向功能基因组学，即对其众多基因产物的解析。目前已有10余个基因的功能得到初步确定，有36个基因与已知的蛋白具有同源性，但大部分基因的功能仍未知。 本研究根据Yang已公布的WSSV基因组全序列(GenBank登录号：NO.AF332093)，设计了一对引物，从疑似患白斑综合症的罗氏沼虾总DNA中，扩增获得WSSV结构蛋白VP28基因，并将之与20个已登录在Genbank上的VP28序列进行同源性比对，证实其为WSSV的VP28基因。系统进化分析结果显示：从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类，印度对虾WSSV VP28为另一类，罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类，关系最远。 选取5个未知功能的ORF区域，相应设计了5对引物，从疑似患白斑综合症的罗氏沼虾中获得的WSSV基因组为模板，经扩增可清晰获得该5个未知基因，并分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)中；根据测序结果对WSSV ORF023和ORF254区域推测的蛋白进行蛋白理化特性、蛋白序列(Motif)特性以及二级结构预测。 将WSSV ORF023和ORF254基因在大肠杆菌BL21中进行表达，结果显示，WSSV ORF023基因表达产物比预计的略小，WSSV ORF254基因有多条偏小的特异性条带，推测可能与基因中存在的大肠杆菌稀有密码子有关。同时还将获得的WSSVORF147基因，克隆进pBacPAK-His(1)，构建了可用于家蚕杆状病毒系统表达的真核表达载体pBacPAK-His(1)-WSSV ORF147，为在昆虫细胞中表达WSSV ORF147打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1 WSSV起源

2 WSSV的形态结构

3 WSSV的流行病学

4 WSSV病理学研究概况

4.1 WSSV的病症及病理变化

4.2 WSSV在对虾体内的分布及感染顺序

4.3 WSSV的检测

5 WSSV的分子生物学研究概况

5.1 WSSV多肽

5.2 WSSV基因组

5.3基因组学研究的一些方法

6对虾细胞培养研究进展

参考文献

第二章材料与方法

1实验材料

1.1生物材料

1.2工具酶及试剂盒

1.3其他试剂

1.4主要实验试剂与配制

2实验常用仪器设备

3常用方法

3.1基因组DNA提取

3.2目的基因的PCR扩增

3.3碱裂解法制备质粒DNA

3.4感受态细胞的制备

3.5重组DNA的转化

3.6酶切反应

3.7连接反应

3.8琼脂糖凝胶电泳

3.9 SDS-PAGE蛋白质电泳

参考文献

第三章罗氏沼虾WSSVVP28基因和5个未知功能ORF基因的克隆和分析

1材料与方法

1.1试验材料

1.2引物设计

1.3克隆策略图

2结果和分析

2.1 VP28基因的克隆

2.2 WSSV ORF023、254、464、131、390和234的PCR扩增

2.3 WSSV 5个ORF的克隆

2.4 WSSV VP28及5个ORF的序列分析

2.5 WSSV VP28系统进化分析

2.6罗氏沼虾WSSV ORF023和ORF254序列的生物信息学分析

3 讨论

3.1 WSSV的诊断

3.2 WSSV ORF023基因特点

3.3 WSSV ORF254基因特点

参考文献

第四章罗氏沼虾WSSV ORF023和ORF254在大肠杆菌BL21中的表达

1材料和方法

1.1实验材料

1.2 WSSV ORF023和ORE254的原核诱导表达

1.3表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析

1.4 WSSV ORF023和ORF254稀有密码子分析方法

2结果和分析

2.1 WSSV ORF023的原核诱导表达

2.2 WSSV ORF254的原核诱导表达

2.3罗氏沼虾WSSV ORF023和ORF254基因稀有密码子分析

3讨论

参考文献

第5章罗氏沼虾WSSV ORF147真核表达载体的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2重组质粒pBacPAK-His(1)-WSSV ORF147的构建

2结果和分析

3讨论

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文

致谢