JAK2V617F突变在骨髓增殖性肿瘤和急性髓性白血病(M2)中的实验和临床研究

摘要

[背景与目的] 近年来慢性骨髓增殖性肿瘤(MPN)发病机制的研究取得了重要进展，2005年几个研究小组几乎同时发现，MPN患者造血细胞信号传导分子JAK2基因第1849位鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取替，导致JAK2激酶617位缬氨酸(V)错义编码为苯丙氨酸(JAK2V617F)，使JAK2分子得到持续活化，此改变可能与MPN的发病有密切的关联，并发现在绝大多数真性红细胞增多症(PV)患者和半数左右原发性血小板增多症(ET)患者及原发性骨髓纤维化(MF)患者中能检测到此突变，而在骨髓增生异常综合症、急性白血病患者中偶尔也能检测到此突变。随着研究的深入，发现此突变有两种类型——纯合型突变和杂合型突变，并发现突变型JAK2V617F与野生型JAK2基因的比例决定MPN的表型。因此，对JAK2V617F突变的研究有利于MPN的诊断，判定疾病的预后和未来靶向治疗靶点的选择，成为MPN研究的热点。近年国内对JAK2V617F突变的研究主要集中于临床检测，未能做到对此突变的进一步基因分型和相对定量研究，针对此我们研究了中国人MPN患者和急性白血病M2型患者中JAK2V617F突变的发病率、基因分型、相对定量情况和临床资料间的关系，总结如下。 [方法] 第一部分第一章选取2005年8月～2008年10月该院门诊就诊MPN患者，按照2001年WHO分类诊断标准选择患者，采集患者外周血5ml，Ficoll-paque分离单个核细胞，运用基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的抽提，采用等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)扩增JAK2基因，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选出突变阳性患者PCR产物进行测序证实，收集患者的临床资料、染色体结果及随访结果。 第一部分第二章选取2006年1月到2008年6月间到该院就诊的急性白血病M2型患者及部分我所冻存标本作为研究对象，按照《血液学诊断及疗效标准》选择患者，收集患者的临床资料，采集患者的外周血，运用AS-PCR(同第一部分第一章)扩增JAK2基因，并结合临床资料进行研究。 第二部分和第三部分选取2006年1月到2008年6月间到该院就诊的MPN患者及部分该所冻存标本作为研究对象，按照2001年世界卫生组织(WHO)慢性骨髓增殖性疾病诊断标准选择患者，采集患者外周血10ml，Ficoll-paque分离单个核细胞，Trizol一步法抽提总RNA，应用鼠源逆转录酶将RNA逆转录为互补cDNA，采用ARMS-PCR技术扩增JAK2基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型，筛选出突变阳性患者PCR产物进行测序证实，并经毛细管电泳进行JAK2V617F突变转录本水平的相对定量分析，染色体检查按照常规R显带技术进行，同时分析检测结果与临床间的关系。 [结果] 1.运用AS-PCR方法检测了412例MPN患者，根据检测结果结合临床资料显示：共发现277例患者JAK2V617F突变阳性，JAK2V617F突变在原发性血小板增多症(ET)、特发性骨髓纤维化(IMF)及不能分类的骨髓增殖性疾病(MPD-U)中发生率分别为55.9％、66.7％和52.4％，差异无统计学意义，但均较真性红细胞增多症(PV)中JAK2V617F发生率(95.6％)为低；JAK2突变型患者的平均年龄高于野生型患者；JAK2V617F阳性组的白细胞水平及血红蛋白水平均较JAK2V617F阴性组为高；JAK2V617阳性组中血管事件发生率高于阴性组；具有JAK2V617F阳性的MPD-U患者较阴性MPD-U患者更易进展为典型MPN；301例进行过染色体检查的患者中，18例存在核型异常，未发现核型异常与JAK2V617F突变之间存在相关性。 2.运用AS-PCR方法检测了80例AML-M2患者，根据检测结果结合临床资料显示：80例AML-M2患者中共发现JAK2V617F阳性7例，6例为初诊患者，1例为复发患者，总阳性率8.8％；7例JAK2V617F阳性AML-M2患者形态学上血象、骨髓象呈现出白血病改变特征，并无骨髓增殖性疾病(MPD)症象，免疫分型显示为髓系表达；本院治疗5例JAK2V617F阳性AML-M2患者，4例经2疗程诱导治疗达完全缓解(CR)，1例未缓解(NR)；5例JAK2V617F阳性AML-M2患者，除1例失访外，其余4例总生存期(0S)中位值为18.5个月。 3.运用ARMS-PCR联合毛细管电泳检测123例MPN患者，结果显示： JAK2V617F阳性90例，其中35例真性红细胞增多症(PV)患者中JAK2V617F阳性35例，阳性率100％(35/35)，85例原发性血小板增多症(ET)患者中JAK2V617F阳性53例，阳性率62.4％(53/85)，低于PV患者，差别有显著性；3例慢性骨髓纤维化(IMF)患者中JAK2V617F阳性2例，阳性率66.7％(2/3)。90例JAK2V617F突变患者中共检出纯合突变35例，其中PV患者17例(17/35)占48.6％，ET患者17例(17/85)占20％，低于PV患者，差别有显著性，IMF患者1例；90例毛细管电泳定量分析显示，35例纯合型突变患者JAK2V617F突变转录本水平为(89.5±6.5)％，55例杂合型突变患者JAK2V617F突变转录本水平为(57.9±6.7)％，较纯合型突变患者为低，差别有显著性；杂合型PV患者JAK2V617F突变转录本水平为(63.7±6.3)％，高于杂和型ET患者的(54.4±6.1)％，差别有显著性。93例患者进行了染色体检查，6例有核型异常，但未发现特异性染色体改变。 4.运用ARMS-PCR联合毛细管电泳检测了131例MPN患者，根据检测结果结合临床资料显示：纯合型JAK2V617F突变ET患者和杂合型JAK2V617F突变ET患者其发病年龄均较野生型患者为高；MPN患者中年龄与JAK2V617F突变的发生间存在相关性，≥60岁患者JAK2V617F突变转录本水平高于<60岁患者；JAK2V617F突变阳性MPN患者(PV和ET)白细胞和血红蛋白水平均高于阴性患者，ET患者中纯合型突变者白细胞水平高于杂合型突变者；JAK2V617F突变在PV中的发生率和JAK2V617F纯合型突变在PV中的发生率均较JAK2V617F突变在ET中的发生率和JAK2V617F纯合型突变在ET中的发生率为高；JAK2V617F转录本水平均值在PV、ET和IMF患者中无差别。 5.运用ARMS-PCR联合毛细管电泳检测了105例MPN患者，根据检测结果结合临床资料显示：有血栓PV、ET患者年龄、WBC数高于无血栓患者，WBC≥15×109/LET患者血栓发生率高于WBC<15×109/L患者，JAK2V617F阳性患者血栓发生率高于阴性患者，有血栓事件者JAK2V617F转录本水平高于无血栓事件者，JAK2V617F阳性患者血栓事件风险度高于JAK2V617F阴性患者，突变转录本水平在(60-100)％组患者血栓事件风险度高于JAK2V617F阴性组患者。 [结论] 1.JAK2V617F突变与MPN患者年龄、外周血细胞计数及血管事件之间存在关联性，JAK2V617F的检测对判定MPN-U患者疾病转归有提示作用。 2.作为AML发病机制中的I类改变JAK2V617F突变可能并非是AML发病的初始事件，而是其发病的额外事件，初诊AML患者出现此改变也并非意味着疾病预后较差。 3.ARMS-PCR可作为JAK2V617突变分型较准确的检测方法，结合毛细管电泳可用于此突变的相对定量分析。 4.ARMS-PCR结合毛细管电泳定性和定量分析JAK2V617F突变可用于MPN的诊断、预后判定和微小残留病的检测。 5.高龄、白细胞计数增高，JAK2V617F突变及高转录本水平MPN患者血栓风险可能较高。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

引 言

第一部分JAK2V617F突变的定性分析及临床意义

第一章412例骨髓增殖性肿瘤JAK2V617F突变与临床特征和预后的关系研究

前言

实验材料和方法

结 果

讨论

参考文献

第二章80例急性髓性白血病M2型患者JAK2V617F突变的检测及临床意义

前言

实验材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分JAK2V617F突变在骨髓增殖性疾病中的定量分析及临床意义

第一章ARMS-PCR定量检测JAK2V617F方法学的建立

第一节Quantitative Assay for Janus Kinase 2(JAK2)Mutation in Chinese Patients with Chronic Myeloproliferative Disorders

第二节 123例慢性骨髓增殖性疾病患者JAK2基因突变的定量研究

第二章 定量检测JAK2V617F在MPN中的临床应用慢性骨髓增殖性疾病131例患者JAK2V617F突变的定量分析及临床意义

第三部分 慢性骨髓增殖性肿瘤患者JAK2V617F突变与血栓形成间的关系

前言

实验材料与方法

结 果

讨论

参考文献

结论

综述慢性骨髓增生性肿瘤的发病机制

攻读学位期间公开发表的论文、参加学术会议

致 谢