再上皮化预防气管移植后闭塞性气道疾病的作用研究

摘要

研究背景：“再上皮化”是同种异体原位气管移植所面临的最大难题之一，目前仍然停留在实验阶段。同种异体原位气管移植后的再上皮化过程一旦不能完成，则移植气管将受到免疫排斥因而发生粘膜下结缔组织增生、淋巴细胞浸润、气管管腔闭塞等一系列的病理改变，即称为OAD(气道闭塞性疾病)。关于上皮组织再生对于OAD发生的影响，实验研究集中采用啮齿类动物的异位气管移植和原位气管移植两种模型得以实现。本实验拟针对上述两种模型的建立方法和OAD病理组织学特征、该模型中受体上皮再生对于防止OAD的作用、以及在此模型中应用细胞种植的方法实现上皮再生、维护上皮完整性、改善和防止OAD发生等方面进行研究。 第一部分代表OAD典型病理结果的鼠气管移植模型。 研究目的：建立代表OAD典型病理结果的鼠异位和原位气管移植模型。材料和方法：SPF级BALB/c(供体)和C57BL/6(受体)小鼠共80只，分别设立实验组(异系移植)和对照组(同系移植)，并分别建立原位和异位气管移植。获取供体小鼠的长段气管后，用手术方法直接种植于同种异系的受体鼠背部皮下，建立异位气管移植模型。另取供体小鼠的长段气管，用手术方法与受体鼠的气管行端端吻合，建立原位移植模型。结果：异系小鼠行异位移植四周后，供体气管段发生显著的纤维结缔组织增生、大量淋巴细胞浸润、管腔闭塞等，为典型的OAD病理表现。原位气管移植4周后该移植气管管腔通畅，纤毛上皮完整，粘膜下组织轻度增生，少量淋巴细胞浸润，和异位移植模型构成了显著的病理组织学对比。结论：通过本实验建立了具有典型OAD病理表现的实验动物模型。原位气管移植和异位气管移植的不同病理结局，说明两种移植方式后的供体气管发生了组织学上的重新构建。 第二部分受体来源的上皮细胞再生对于OAD发生的作用。 研究目的：利用鼠异位和原位气管移植模型，证明受体来源的上皮细胞再生是防止OAD发生的关键环节。材料和方法：SPF级BALB/c(供体)和C57BL/6(受体)小鼠共80只，分别设为四组：异位异系、原位异系、异位同系、原位同系组。移植后4周，分别观察移植气管段的病理组织学特征、作定量形态学分析(LCR、粘膜下层纤维组织的面积、纤毛上皮的比例)、检测血CD4+CD8+淋巴细胞表达率、并鉴定移植气管的上皮表型。结果：①所有供受体同为Balb/c的实验组，测定的LCR、纤维组织面积和纤毛上皮比例和正常气管相比，统计学无明显差异。异位异系小鼠间的气管移植(Balb/c→B1/6)，由于在4周终点所有移植气管的管腔均发生闭塞，只能做纤维组织面积的粗略测定，与正常气管相比P<0.01，与其它各组相比P<0.05。所有原位异系小鼠的气管移植，即(Balb/c→B1/6，颈部原位移植)，测得的LCR和正常气管统计学差异显著P<0.05，纤毛上皮比例亦有统计学差异P<0.05。原位同系小鼠间的移植气管，在LCR、纤维像素面积、纤毛上皮比率等指标上，与正常气管无统计学差异。②原位移植的供体Balb/c气管，具有阳性的B1/6小鼠的上皮抗原性表达(H2Kd抗原)。③各实验组的小鼠CD4+/CD8+阳性表达率的统计学差异不明显。结论：在原位气管移植模型中，由于受体上皮细胞能够移行和充分覆盖供体气管并完成再上皮化，从而能维持供体气管的管腔通畅。气管上皮组织的抗原性来源是OAD发生的关键环节。 第三部分上皮细胞种植对于防止OAD发生的作用。 研究目的：探讨受体来源的上皮细胞种植对于防止供体裸气管发生OAD病理结局的作用。材料和方法：①SPF级SD大鼠(受体)和Wistar大鼠(供体)各30只；②SD大鼠上皮细胞行体外培养：③所有移植气管获取后，进行酶消化上皮细胞，制成供体裸气管；④实验设为四组，分别取体外培养的SD大鼠上皮细胞、消化得到的Wistar大鼠上皮细胞、培养基和0.9％氯化钠注射液进行供体Wistar大鼠裸气管的管腔内灌注，然后行异位气管移植，将供体气管种植于受体SD大鼠皮下。移植气管于移植后4周获取，行病理组织学检查。同时检测受体鼠的血CD4+/CD8+T淋巴细胞比率。结果：上皮细胞灌注的实验组气管，管腔维持通畅完整，粘膜下结缔组织有部分增生，管腔内可见到较为完整的纤毛上皮组织。培养基和生理盐水灌注组的病理组织学特征相类似，均表现为管腔的闭锁、上皮组织缺失、显著的淋巴细胞浸润和管腔内的纤维结缔组织增生，即典型的OAD特征。受体大鼠的CD4+/CD8+比率，上皮细胞种植组为1.5±0.3，和生理盐水灌注的对照组1.6±0.3无明显统计学差异。结论：上皮组织的抗原性和完整性都是影响同种异体气管移植中OAD病理结果的必要因素。外源性上皮细胞在管腔内的存在、并形成具有受体抗原性(SD大鼠)的上皮组织层，有效的防止了OAD的发生。提示体外培养的上皮细胞可能通过种植的方式，达到完全的再上皮化。 第四部分细胞种植后新生上皮组织的完整性和屏障功能。 研究目的：探讨受体来源的上皮细胞种植于供体气管管腔后，是否能建立屏障功能并维护上皮组织的完整性。材料和方法：①SPF级SD大鼠(受体)和Wistar大鼠(供体)各30只；②SD大鼠上皮细胞行体外培养；③所有移植气管获取后，进行酶消化上皮细胞，制成供体裸气管；④实验设为三组，分别取体外培养的SD大鼠上皮细胞、培养基、和0.9％氯化钠注射液进行供体Wistar大鼠裸气管的管腔内灌注，然后行异位气管移植，将供体Wistar大鼠气管种植于受体SD大鼠皮下。移植气管于移植后4周获取，行病理组织学、上皮组织的超微结构检查；行移植气管的CK14、CK18、CFTR和ZO-1免疫组化染色。结果：①新形成的柱状上皮细胞具有明显的纤毛结构，具有完整的细胞器结构，含有丰富的线粒体。上皮细胞间距离窄，且已具备完整的紧密连接。②新生的上皮组织层中，CK14、ZO-1和CFTR呈阳性表达。结论：体外培养的上皮细胞可以通过种植的手段，在异系受体鼠体内形成具有较为完整的屏障功能的上皮结构，从而得到保护供体气管、维持管腔通畅的病理结局。 总结： ①鼠原位和异位气管移植模型反映了OAD的病理结果，可作为OAD研究的动物模型；②鼠原位和异位气管移植得到的迥然相异的OAD病理表现，充分提示了气管上皮组织在OAD发生发展中的重要作用；③上皮组织的表型转换(再上皮化，即供体气管段具有受体源性的上皮组织)，是维持供体气管通畅的关键环节；④通过体外培养气道上皮细胞，再进行供体裸气管管腔内的种植，将能够达到保护供体气管、维持管腔通畅的作用；⑤向供体气管管腔内种植的上皮细胞，能有效分化为较成熟的上皮组织，并具有较为完善的屏障功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分代表OAD典型病理结果的鼠气管移植模型

一、异位气管移植模型的建立

二、原位气管移植模型的建立

三、讨论

第二部分受体来源的上皮细胞再生对于OAD发生的作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分上皮细胞种植对于防止OAD发生的作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第四部分细胞种植后新生上皮组织的完整性和屏障功能

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

结论

参考文献

综述一：呼吸道上皮在移植后闭塞性细支气管炎中的作用研究进展

综述二:内皮素-1在移植后闭塞性细支气管炎中的作用研究

攻读学位期间公开发表的论文

致谢