环介导等温扩增检测单纯疱疹病毒DNA方法的建立和应用

摘要

目的：建立一种灵敏度高、特异性强、成本低，适于基层检测孕妇血清中HSV DNA的方法，并初步评价该技术在临床应用价值。 方法：分别设计了HSV—Ⅰ和HSV—Ⅱ型特异的环介导等温扩增（Loop—mediated isothermal amplification LAMP）引物，并利用该技术建立了快速检测HSV DNA的反应体系。并针对影响LAMP反应的因素，对反应体系进行了优化，确定了LAMP检测HSV DNA的最佳反应条件，初步鉴定了我们所建立方法的敏感性和特异性。在此基础上，对我们所收集的96例孕妇外周血标本进行了检测，并与传统的ELISA和荧光定量PCR做了比较。 结果：通过对LAMP检测HSV DNA反应体系的优化，实验结果表明温度是LAMP最大的影响因素，甜菜碱也是LAMP反应能否进行的关键因素，镁离子等其他因素相对温度和甜菜碱的影响较小。特异性鉴定结果表明仅单纯疱疹病毒型特异性检测为阳性，而对同属的其他类型的疱疹及人类基因组DNA检测均为阴性，酶切鉴定结果进一步证明了扩增的特异性。敏感性检测下限为每反应管（25μl的反应体系）10个拷贝。对96例孕妇血清标本分别进行HSV—Ⅰ DNA和HSV—Ⅱ DNA检测，HSV—Ⅰ阳性例数为9例，HSV—Ⅱ阳性例数为16例，并与ELISA和FQ—PCR检测结果作比较。以FQ—PCR为检测金标准，LAMP与FQ—PCR阳性符合率大于94％，两种方法差异不显著（P>0．01）；而ELISA与FQ—PCR相比，存在显著性差异（P<0．01）。 结论：实验表明LAMP技术用于HSV DNA检测具有与FQ—PCR相近的特异性和敏感性，可靠性远高于目前普及的ELISA法。并且LAMP技术简单快速、结果易判断、成本低。如果进一步优化、完善和推广，我们相信该技术将会在孕妇HSV感染的早期诊断和出生缺陷及传染病的预防上发挥重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表(Abbreviations)

声明

前 言

第一章环介导的等温扩增检测单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA方法的建立

1实验材料

1.1标本收集

1.2实验仪器与设备

1.3常用的材料与试剂

1.4主要试剂及配方

2实验方法

2.1克隆HSV-II基因组中的目的基因片段

2.2 LAMP检测HSV-Ⅱ DNA方法的建立

3实验结果

3.1 PCR扩增结果及重组质粒的鉴定

3.2测序结果

3.3 LAMP反应体系的优化

3.4 LAMP检测HSV-2 DNA

3.5 LAMP反应的特异性

3.6 LAMP反应的敏感性

4讨论

4.1建立等温扩增检测HSV-Ⅱ DNA方法的意义

4.2等温扩增反应体系的优化

4.3等温扩增反应体系的特异性

4.4 LAMP反应的敏感性检测

第二章环介导的等温扩增检测孕妇血清中HSV-Ⅰ DNA方法的建立

1实验材料

1.1标本来源

1.2常用的材料与试剂

1.3仪器与设备

1.4主要试剂和配方

2实验方法

2.1克隆HSV-Ⅰ基因组中目的基因片段

2.2 LAMP检测HSV-Ⅰ DNA方法的建立

3实验结果

3.1 阳性模板的克隆

3.2 LAMP反应条件优化的结果

3.3最佳反应条件下LAMP检测HSV-Ⅰ-DNA

3.4 LAMP法特异性检测

3.5 LAMP反应的敏感性

4讨论

4.1建立等温扩增检测HSV-Ⅰ DNA方法的意义

4.2等温扩增反应体系的优化

4.3等温扩增反应体系的特异性

4.4 LAMP反应的敏感性检测

第三章环介导等温扩增法检测孕妇血清中HSV DNA方法初步应用

1实验材料

1.1标本的收集

1.2标本的收集与处理

1.3常用的材料与试剂

1.4主要仪器与耗材

2实验方法

2.1模板DNA的制备

2.2 LAMP方法检测HSV DNA

2.3 FQ-PCR方法检测HSV

2.4 ELISA检测HSV IgM方法

2.5数据统计学处理

3实验结果

3.1 LAMP、ELISA法与FQ-PCR法检测HSV-Ⅱ结果比较

3.2LAMP、ELISA法与FQ-PCR法检测HSV-I结果比较

4讨论

结 论

参考文献

文献综述：TORCH感染及诊断的研究概况

研究生期间发表的文章

致 谢