人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的制备和应用研究

摘要

血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VWF）是一种重要的血浆糖蛋白，是血栓形成过程中的一个重要相关蛋白，由血管内皮细胞合成，贮存于Weible-Palade小体内，骨髓巨核细胞也合成VWF，贮存在血小板α颗粒内的。正常人血浆VWF浓度约为10mg/L。VWF基因位于第12号染色体，长178kb，由52个外显子与51个内含子组成。
　　 VWF分子包含4个不同的功能结构域，其排列为NH2-D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-COOH。A1区为血小板膜糖蛋白（Gp）Ib结合部位，A3区为胶原结合部位，C1区为血小板GpⅡb/Ⅲa结合部位，D'区为因子Ⅷ结合部位。其中A1区是瑞斯托霉素（Ristocetin）、博托霉素（Botrocetin）的结合位点，也是肝素、Ⅵ型胶原的结合位点，是VWF与血小板结合的关键部位。
　　 VWF多聚体是起着连接血小板和内皮下基质的桥梁作用，通过内皮下基质胶原同VWF-A3区的结合，以及GpIbα同VWF-A1区的结合。VWF同血小板平时共存于循环血液中，不发生相互作用，当血管内皮细胞受到损伤时，如外源性分子，蛇毒蛋白博托霉素的作用-内皮下胶原等细胞外基质暴露，与血液中VWF-A3区结合，使VWF构型发生改变，或者在高剪切力条件下VWF构型发生改变，暴露了与血小板GpIb结合的位点，即VWF-A1区，从而使血小板不断附着在受损血管壁部位，黏附的血小板或受到血小板激活剂（如胶原、凝血酶等）作用的血小板会发生一系列反应，包括花生四烯酸代谢，产生血栓烷A2（TXA2）和释放出细胞内颗粒内容物（ADP等），最后导致血小板GpⅡb/Ⅲa复合物的构型改变，形成粘附分子受体，并通过与纤维蛋白原的结合而使血小板之间相互黏附、聚集成团，在血管破损处形成早期血栓。
　　 血栓性疾病一直就是危害人类健康的重要疾病之一，抗血栓治疗近年来也取得了巨大的进步，主要是抗血小板CpⅡb/Ⅲa药物的出现，如ReoPro，此类药物作用于血小板聚集的最终途径，抑制血小板GpⅡb/Ⅲa同纤维蛋白原的结合，从而阻止血栓的形成，但是这类药物的缺点也很突出，就是直接抑制了血小板的聚集，这样的结果就是会产生较高的出血倾向。
　　 2002年，Science杂志发表了GpIbα同VWF-A1区复合物结构一文，明确了GpIbα同VWF-A1区结合位点，指出了这一结合位点对血小板黏附的影响，对今后开发新型抗血栓药物提供了新思路。因此抗VWF-A1区单抗的研制将对血小板黏附的机理研究，血栓形成早期的机理研究以及抗血栓药物的研制提供有力的工具。
　　 我们用自己构建的VWF-A1区表达载体，诱导表达。VWF-A1区原核蛋白，经Ni-NTA Agarose凝胶柱纯化，将rVWF-A1作为抗原，免疫Balb/c小鼠，经杂交瘤技术获得了三株抗人VWF-A1区单克隆抗体，分别命名为SZ-129、SZ-130、SZ-131。琼脂糖双扩散鉴定三株单抗均为IgG1亚类；ELISA法测定其腹水效价分别约为1×10-5、2×10-5、5×10-5；经Protein G-Sepharose4B亲和层析柱纯化所得的抗体浓度分别为2mg/ml、1.26mg/ml、2.38mg/ml。ELISA和Western blot显示SZ-129、SZ-130和SZ-131都能与原核表达的rVWF-A1和纯化的人血浆VWF蛋白特异结合；免疫细胞化学实验也证实，SZ-129和SZ-130都能特异的结合内皮细胞中的VWF；血小板聚集试验显示，SZ-129和SZ-130能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集，并且该抑制具有一定的量效关系。SZ-129能抑制博托霉素诱导的血小板聚集；SZ-129和SZ-130都不能抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集。而VWF同GpIb结合抑制实验表明，SZ-129和SZ-130作用于VWF后，抑制了VWF同血小板GpIbα的结合；流动小室实验表明，SZ-129作用于VWF后，抑制了VWF同血小板的结合，减少了血小板在固相化VWF上的黏附。以上试验初步显示，SZ-129、SZ-130、SZ-131作用于VWF-A1区，SZ-129和SZ-130能抑制VWF与血小板GpIb的结合，特别是SZ-129，在体外能减少血小板黏附于VWF，通过改造，具有成为抗血小板黏附，甚至是抗血栓药物的可能。
　　 VWF上的各个结构域具备的结合活性目前基本已经明确，如今VWF的研究热点是胶原-VWF-GpIb轴，抑制胶原同VWF的结合，或者抑制VWF同Gpro的结合，都能较好的抑制血小板黏附，从而阻碍血小板聚集，减少血栓的形成。我们把目标放在VWF-A1区，通过研制新的抗VWF-A1区单克隆抗体，希望能找到抑制VWF同GpIb结合的单抗，为今后新型抗血栓药物的研制提供一个良好的工具。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一部分 人血管性血友病因子A1区原核蛋白的表达和鉴定

第一章 人血管性血友病因子A1区原核蛋白的设计合成

第二章 人血管性血友病因子A1区原核蛋白的鉴定

第二部分 抗人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的制备和鉴定

第一章 抗人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的制备

第二章 抗人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的鉴定

第三部分 抗人血管性血友病因子A1区单克隆抗体的应用研究

第一章 抗人血管性血友病因子A1区单克隆抗体在血小板聚集中的作用

第二章 抗人血管性血友病因子A1区单克隆抗体在血小板黏附中的作用

结 论

参考文献

综述 抗血小板黏附药物研究进展

攻读学位期间公开发表的论文

致谢