RNA干扰抑制硫氧还蛋白基因增强人脑胶质瘤U251对三氧化二砷敏感性的研究

摘要

目的:探讨硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)在人胶质瘤U251对三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)的敏感性中的作用。
　　方法:(1)用5μmol/L As2O3分别处理U251细胞不同的时间梯度:0 h,6 h,12 h,24 h和48 h,采用MTT法和Hoechst33242染核法检测5μmol/L As2O3处理对U251增殖和凋亡的影响。采用免疫细胞化学方法检测5μmol/L As2O3处理的U251细胞在不同时间点Trx和Caspase-9的表达。采用Western blotting方法检测在As2O3诱导的细胞凋亡中Trx和Bcl-2表达变化。
　　(2)将Trx干扰质粒:TXN-69,TXN-107,TXN-130,TXN-213和阴性对照质粒转染入U251细胞,然后采用RT-PCR,Western blotting分别检测Trx的mRNA和蛋白水平表达情况,筛选出有效干扰质粒。
　　(3)将筛选出的干扰质粒转染U251,以5μmol/L As2O3处理,设四组:转染阴性对照质粒组,转染Trx干扰质粒组,转染阴性对照质粒组+5μmol/L As2O3组,转染Trx干扰质粒+5μmol/L As2O3组。采用Annexin V-PE/7-AAD染色,流式细胞仪检测RNA干扰Trx基因表达对As2O3诱导的U251的凋亡的影响。
　　结果:(1) MTT结果显示,细胞活力明显降低,呈现As2O3时间依赖性,12 h后显示较强的细胞毒性反应;Hoechst33242染核后荧光显微镜观察表明,As2O3处理12 h之后,部分细胞核出现明显的凋亡特征如呈波纹状改变,部分染色质出现浓缩凝聚、边缘化,甚至细胞核裂解为碎块;随着时间的延长,凋亡细胞的比例明显升高;免疫细胞化学结果显示,Trx及Caspase-9的阳性细胞率也明显增加,Western blotting结果显示,Trx表达水平显著增高,Bcl-2没有明显变化。
　　(2)荧光显微镜观察,质粒成功转入U251细胞;RT-PCR、Western blotting结果显示,干扰质粒能不同程度下调Trx mRNA水平及其蛋白表达,其中干扰质粒TXN-107作用效果最为显著。
　　(3)流式细胞仪检测结果显示,转染TXN-107组与转染阴性质粒组相比,细胞凋亡没有明显差异;但转染TXN-107+5μmol/L As2O3(16 h)组与转染阴性质粒+5μmol/L As2O3(16 h)组相比,U251细胞凋亡明显增加。
　　结论:(1) As2O3能够抑制U251细胞活性,并促进其凋亡,均呈时间依赖性。免疫细胞化学和Western blotting结果发现Trx和Caspase-9参与As2O3诱导的U251细胞凋亡过程,Bcl-2可能不参与As2O3介导的U251细胞凋亡。
　　(2)成功地筛选出Trx mRNA干扰质粒。
　　(3)Trx mRNA干扰不能明显促进U251细胞凋亡,但明显增强U251细胞对As2O3诱导的凋亡的敏感性。

目录

中文摘要

Abstract

前言

参考文献

第一部分 三氧化二砷诱导U251 细胞的凋亡及硫氧还蛋白的表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 RNA 干扰抑制硫氧还蛋白基因并增强U251 对三氧化二砷的敏感性

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

结论

综述

参考文献

缩略词表

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致谢