脐血造血干/祖细胞在丝素膜上向内皮细胞分化及其信号转导机制的研究

摘要

目的：体外分离、纯化脐血CD34+造血干/祖细胞(CD34+细胞),诱导其在再生丝素膜上向内皮细胞分化,并通过对其分化过程中血管内皮生长因子(VEGF)诱导的细胞内信号传导与转录活化因子(STAT)活化的研究,初步揭示CD34+细胞向内皮细胞分化的部分机制。
　　 方法：采集新鲜脐血,磁珠分选法(MACS)分离出CD34+细胞,分别接种到再生丝素膜(SF)和明胶包被的培养皿上,用含有VEGF和纤维细胞生长因子(bFGF)的M199培养基诱导分化。细胞形态学观察CD34+细胞生长情况,流式细胞仪检测诱导前后内皮细胞CD34,CD31及vWF表型,电镜观察验证内皮细胞胞浆内的Weibel-Palade小体(W-P小体),并比较不同材料上CD34+细胞的贴壁率及向内皮细胞分化比率。进一步以丝素蛋白膜为载体培养WI-38人胚肺成纤维细胞,将本科室已构建的腺病毒介导的与干细胞内皮化密切相关的VEGF165基因(即Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1重组腺病毒)转染WI-38细胞,用荧光显微镜、RT-PCR及ELISA法检测VEGF165及Ang-1基因在WI-38细胞中的转录和表达；并将此基因转染WI-38修饰的再生丝素膜倒置漂浮于接种于再生丝素膜上的CD34+细胞的培养基液面上共培养,通过细胞形态学观察,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型等方法与直接加入细胞因子诱导的方式比较CD34+细胞的内皮细胞分化率。另外,用Western印迹法检测分离的CD34+细胞和诱导分化7d、14d细胞中JAK蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)和STAT-3蛋白的表达及其在VEGF作用下的磷酸化水平；以细胞因子VEGF(50 ng/ml)持续刺激分化14d细胞不同时间(5、10、30、60 min)后,Western印迹法和免疫细胞化学法检测细胞内STAT-3的磷酸化及转核；采用能与VEGF受体2(VEGFR2)特异性结合的七肽ATWLPPR封闭VEGF与VEGFR2的结合,Western印迹法观察VEGF刺激分化14d细胞后STAT-3的磷酸化水平；采用JAK-STAT信号通路特异性抑制剂AG490作用于分化14d细胞,Western印迹法检测VEGF刺激后细胞内磷酸化STAT3的表达,同时细胞形态学观察及流式细胞仪检测刚分离的CD34+细胞加入AG490共培养后的细胞生长和分化情况。
　　 结果：⑴本实验成功将CD34+细胞在丝素膜材料上诱导分化为内皮细胞。细胞形态学观察培养2w时细胞长满瓶底并达到增殖高峰,呈“铺路石”状排列；流式细胞仪检测培养10d的细胞显示内皮细胞表型CD31阳性率达70％以上,检测培养14d的细胞显示vWF阳性率可达80％以上；透射电镜可观察到胞浆中的W-P小体;平均贴壁率和分化比率分别可达80％及60％以上,且再生丝素膜对CD34+细胞向内皮细胞分化没有负面影响。⑵培养于再生丝素膜上的WI-38细胞经Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1重组腺病毒感染后,呈现强绿色荧光,VEGF165及Ang-1基因在WI-38细胞中成功转录,ELISA法证实Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1能在WI-38细胞中持续地高表达VEGF165,Ang-1和FGF2等细胞因子,将此基因转染WI-38细胞修饰的再生丝素膜与CD34+细胞共培养第7d时,CD34+细胞的细胞增殖倍数、内皮细胞分化比率以及内皮细胞表型CD31阳性率均比加入细胞因子直接诱导组及其他空白对照组要高,说明基因转染WI-38修饰的再生丝素膜可以更有效的诱导CD34+细胞相内皮方向分化。⑶分离的CD34+细胞和诱导分化7d、14d的细胞在正常静止状态下,均表达一定量的JAK2,而且在所有的时间点JAK2蛋白的表达量类似,随着细胞向内皮细胞分化酪氨酸磷酸化JAK2水平明显增加；STAT3在CD34+细胞分化前即有明显表达,随着向内皮分化,其表达量增加,且随着内皮细胞的分化成熟,STAT3的酪氨酸磷酸化水平提高；VEGF刺激分化14d细胞后胞内可出现迅速而短暂的STAT3磷酸化及转核,且其刺激后不同时间的STAT3酪氨酸磷酸化水平有显著性差异,VEGF刺激对STAT3分子活化具有一定的时间依赖性；ATWLPPR特异性封闭VEGF与VEGFR2的结合后,STAT-3磷酸化被完全阻断；AG490特异性封闭JAK-STAT信号通路后,经VEGF刺激仍可检测到有一定量的磷酸化的STAT3表达,且VEGF+AG490培养的CD34+细胞,仍然可以在一定程度上向内皮细胞分化。表明VEGFR2特异性的介导的STAT信号转导途径可能参与了VEGF诱导的CD34+细胞向内皮细胞分化的调控机制,同时可能有其它信号转导途径参与了VEGF对CD34+细胞的促分化作用。
　　 结论：①成功将CD34+细胞在VEGF等细胞因子的诱导下分化为内皮细胞；②再生丝素膜可作为CD34+细胞向内皮细胞分化的支架材料；③Ad-VEGF165-PolyA—promoter-Ang1重组腺病毒转染WI-38细胞修饰的再生丝素膜能更有效的诱导CD34+细胞向内皮方向分化；④VEGFR2特异性的介导的STAT信号转导途径可能参与了VEGF诱导的CD34+细胞向内皮细胞分化的调控机制。

目录

文摘

英文文摘

引言

参考文献

第一部分 脐血CD34+造血干/祖细胞在再生丝素膜上向内皮细胞分化的研究

第二部分 基因转染成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导脐血CD34+造血干/祖细胞向内皮细胞分化的研究体

第三部分 血管内皮生长因子体外诱导脐血CD34+造血干/祖细胞分化为内皮细胞的信号转导机制的研究

结论

参考文献

综述JAK-STAT信号转导通路的研究新进展

参考文献

攻读硕士学位期间发表和待发表的论文

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