神经干细胞分化影响其对肝细胞因子的趋化性迁移

摘要

神经干细胞（neural stem cells, NSCs）高效迁移的发生在神经系统发育和病理条件下神经系统损伤修复中起着关键作用。越来越多的研究表明，无论是内源的还是外源移植的NSCs都能够通过趋化性迁移到达脑损伤区域，利用NSCs分化特性进行特定损伤部位细胞的定向分化而取代损伤的细胞参与到损伤区域功能的发挥或分泌不同营养因子来改善损伤区域的微环境来促进损伤区域的恢复。NSCs的这种趋化性迁移能力为受损伤神经系统的修复带来了希望，但是NSCs在体内的趋化性迁移行为是个复杂的过程，受到迁移过程中微环境的变化以及细胞自身分化状态等因素的影响。先前的研究主要集中于鉴定脑损伤区域分泌的不同的炎症趋化因子或生长因子在诱导NSCs迁移过程中的作用，但是NSCs在迁移过程中分化状态的改变对其趋化性迁移行为的影响还鲜有报道。本实验主要从新生大鼠侧脑室下区（the subventricularzone, SVZ）来源的原代神经干细胞和神经干细胞系C17.2两个方面对NSCs的分化状态与其趋化性迁移行为的关系这一问题进行了研究。
　　本研究首先从新生远交群（Sprague Dawley, SD）大鼠SVZ区域中分离并纯化出NSCs，发现纯化的NSCs呈nestin阳性，并且表现出很强的增殖能力。同时，用含1％胎牛血清(fatal calf serum, FCS)的H-DMEM对SVZ来源的NSCs进行诱导分化（48 h），通过细胞表面特异性抗原标记（GFAP和β-III tubulin）对分化后的细胞进行鉴定，发现SVZ区域来源的NSCs能分化成神经元（β-III tubulin+）和星形胶质细胞（GFAP+），为后期的实验提供了稳定的细胞来源。
　　肝细胞因子（hepatocyte growth factor, HGF）是脑损伤区域（胶质瘤等）分泌的重要因子之一，并且在体内外实验中均被证明能够诱导NSCs的趋化性迁移。为了研究 NSCs的分化状态与趋化性迁移的关系，我们首先利用延时动态视频（time-lapse video）研究了SVZ来源的NSCs在诱导分化0-48 h的不同阶段下对不同浓度HGF的刺激所做出应答时其迁移行为发生了哪些变化。
　　实验结果发现，与对照组（没有HGF存在的情况下，NSCs分化0-48 h的不同阶段下的趋化性迁移行为）相比，5 ng/ml的HGF显著提高了分化最早期（4 h）的NSCs的迁移速度，未能改变NSCs分化4-48 h内其它分化阶段细胞的迁移速度。而25 ng/ml的HGF显著增加了NSCs在未分化和分化4 h,12 h,20 h和44 h的细胞的迁移速度但未能对分化28 h和分化36 h的NSCs的迁移速度产生影响，并且在NSCs分化4 h，20 h和44 h内的迁移速度显著高于5 ng/ml HGF诱导的迁移速度。与此同时，我们发现，与对照组相比，5 ng/ml HGF未能对分化0-48 h内的NSCs的迁移效率（forward migration index, FMI）产生显著性差异，而25 ng/ml HGF显著性的提高了NSCs分化12 h,20 h,28 h和36 h内的FMI，并且在分化12 h，20 h和36 h内显著高于5 ng/ml HGF实验组。这些现象表明，NSCs对不同浓度的HGF刺激做出的不同应答反应与细胞的分化状态有着密切的关系。
　　为了研究NSCs的分化状态与其迁移行为的相互关系，我们选择了神经干细胞系 C17.2来进一步研究细胞的分化状态对其迁移行为产生的影响以及可能的分子机制，为后期的体内移植研究实验进行准备。首先，我们利用Boyden chamber及Dunn chamber研究了神经干细胞系C17.2在不同分化阶段的的群体迁移和个体迁移行为的变化。Boyden chamber结果发现，下室加入HGF后，不同分化状态下的C17.2细胞迁移至膜下的数目和能够诱导细胞迁移数目最多的HGF浓度都是不同的。分化12 h和1 d的C17.2细胞与未分化和分化3 d的细胞相比表现出对HGF更强的趋化性迁移，随着分化时间的延长，细胞的趋化性迁移能力下降，到分化3 d时细胞的趋化性迁移能力已显著低于未分化状态。Dunn chamber结果表明，细胞在特定的分化状态表现出更强的定向迁移能力。仅在外槽中加入HGF时，与对照组和其它分化状态的细胞相比，C17.2细胞在分化12 h和1 d时的FMI表现出显著性的提高，而迁移速度则随着分化的开始表现出显著性的下降，分化状态之间没有显著性的差异。
　　先前的研究结果表明 PI3K/Akt(phosphatidylinositol3-kinase/Akt)和 ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase-1/2)， SAPK/JNK(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase)，p38MAPK能够参与调节细胞的迁移行为。因此，我们检测了不同分化状态下C17.2细胞内Akt和MAPKs(mitogen-activated protein kinases)蛋白的表达变化，发现在不同分化状态下，Akt和MAPKs蛋白的磷酸化水平和变化趋势都是不同的并且与细胞的分化状态有着紧密的联系。最后，我们通过抑制不同的信号通路研究发现：当抑制 ERK1/2信号通路后，HGF刺激诱导的分化0 h,12 h和1d的C17.2细胞的迁移数目表现出显著性下降，但是对分化3 d的细胞迁移数目没有显著性影响。而当干扰掉PI3K/Akt, p38MAPK或者SAPK/JNK信号通路时则只能分别抑制分化12 h,0 h和1 d的特定分化状态下的C17.2细胞的迁移数目，并且这种下降的程度与细胞的分化状态有着紧密的关联。同时，Dunn chamber结果发现，当PI3K/Akt或者MAPKs信号通路被抑制后所引起的细胞在特定分化状态下细胞迁移数目的显著性下降主要是由于细胞在特定分化状态下的迁移速度和（或者）FMI的显著性下降，并且这种迁移速度和FMI的显著性下降的程度与细胞的分化状态之间也存在着紧密的关联。
　　以上的结果表明，NSCs的分化状态对HGF诱导的NSCs的趋化性迁移行为产生重要的影响，在不同分化状态下的NSCs具有不同的趋化性迁移能力，这种迁移能力的不同受到PI3K/Akt和MAPKs的调节并依赖于细胞的分化状态。以上结论说明NSCs的趋化性迁移能力与其分化状态之间存在着紧密的联系，在细胞分化的过程中可能存在一个特殊的时期，处于这一时期的细胞对诱导因子HGF表现出更强的定向迁移能力。NSCs分化状态影响其对诱导因子的趋化性迁移是一个普遍的现象，实验室关于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，干细胞因子（stem cell factor, SCF），血小板衍生因子（platelet derived growth factor, PDGF）的研究同样证明了这种现象的存在，虽然进一步的分子机制仍待于探索，但是我们的研究结果为临床移植 NSCs来治疗脑损伤和中枢神经系统疾病提供了更加丰富的理论基础。

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序 言

参考文献

第一部分 HGF对不同分化状态下原代NSCs趋化迁移能力的影响

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

第二部分 HGF对不同分化状态下C17.2细胞迁移能力的影响

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

结 论

综述：成体神经干细胞在哺乳动物中的研究进展

参考文献

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

本研究所获基金资助

缩略词表(Abbreviation)

致谢