血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定的酶联免疫分析试剂盒的研制及临床应用

摘要

研究背景：
　　 血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一种大分子量的具有粘附功能的多聚体糖蛋白，在止血和血栓过程中发挥着重要作用。首先，vWF可通过与血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)I b和受损伤内皮细胞暴露的胶原之间的桥联作用介导血小板粘附到血管壁：其次，vWF作为凝血因子Ⅷ的载体，保护因子Ⅷ免受活化的蛋白C降解。vWF量的减少或质的异常均能导致血管性血友病(von Willebrand’sdiseases，vWD)的发生。vWD是一组高度异质性、最常见的出血性疾病之一，资料表明其患病率约为社会人群的0.1～1％，有出血表现需要治疗者约1/1万。由于vWD患者vWF抗原水平可能正常，因此除检测vWF抗原外，还应同时检测vWF的活性。血浆vWF瑞斯托霉素辅因子活性(vWF ristocetin cofactor activity，vWF：RCof)测定是最常用的vWF活性检测试验，有利于血管性血友病诊断、分型和治疗监测。国内目前主要应用血液凝集仪检测vWF：Rcof，但其批内变异和批间变异都较大；2000年Vanhoorelbeke等报道了应用抗血小板GPIbα单克隆抗体2D4建立血管性血友病因子瑞斯托霉素辅因子活性测定的酶联免疫分析方法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)，该法与聚集法相比批内和批间差异小；重复性好；不需要使用血小板，而使用重组真核表达GPIbα H1-V289片段(rfGPIbα，H1-V289)。本研究研制了具有自主知识产权的抗血小板GPIbα单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)SZ-151替代国外的2D4，降低检测成本，建立一种操作简单，特异性、敏感性高的检测方法，并可制成国产化的ELISA试剂盒，更易于临床推广应用。为中国人群中vWD患者尤其是2型vWD的分子病理机制研究及明确诊断和分型提供更可靠的依据，有助于临床医生对vWD的诊断和治疗，将具有较大的经济和社会效益。
　　 目的：
　　 (1)制备能用于临床检测血浆vWF：RCof的抗GPIbα的mAb，为开发诊断试剂盒打下基础。
　　 (2)制备重组血小板膜糖蛋白Ibα(rfGPIbα)纯品。
　　 (3)应用抗GPIbα mAb和rfGPIbα建立vWF：Rcof-ELISA方法，对其进行灵敏度、批内和批间差异等方法学考核。
　　 (4)将该方法用于临床标本检测并评价其临床诊断价值。
　　 方法：
　　 (1)应用标准的杂交瘤技术，制备1株抗GPIba的mAb SZ-151。
　　 (2)用真核细胞(CHO细胞)培养表达rfGPIbα H1-V289(包含IgG Fc段)，用亲和层析法纯化rfGPIbα H1-V289，并用生化手段鉴定其纯度、免疫学活性和生物学活性。
　　 (3)vWF：RCof-ELISA的建立：以抗GPIbα单抗SZ-151-IgG包板，加入rfGPIbαH1-V289反应后，再加入待测血浆和瑞斯托霉素，小剂量瑞斯托霉素可诱导血浆vWF和GPIbα结合，最后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记兔抗人vWF多克隆抗体，四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)显色后，酶标仪读取吸光度值(OD)。
　　 (4)应用该方法检测36名正常人及25名vWD患者血浆vWF的瑞斯托霉素辅因子活性，对其灵敏度及批内、批间差异进行方法学评估，与国外的抗GPIbα单抗2D4-IgG包板所测结果进行比较，并分析与vWF抗原、胶原结合实验的相关性。
　　 结果：
　　 (1)成功制备和鉴定了1株抗人GPIbα mAb，命名为SZ-151。ELISA结果显示，SZ-151对瑞斯托霉素辅因子活性无抑制作用。
　　 (2)每1 L培养上清液可纯化获得2 mg rfGPIbα H1-V289蛋白纯品。
　　 (3)成功建立Rcof-ELISA检测试剂盒。
　　 (4)其灵敏度：该方法最低检出限(detection limit，DL)为0.01U/dL。
　　 重复性：该方法测定血浆vWF的瑞斯托霉素辅因子活性的批内差异和批间差异分别8％和12％。
　　 (5)临床应用：应用本法测定36名正常人及25名vWD患者血浆vWF的瑞斯托霉素辅因子活性，正常人均值为91.5U/dL(47.3-169.2 U/dL)，1型vWD均值为31.8U/dL(22.3.56.9 U/dL)，2A型vWD均值为4.8U/dL(0.6-11.8U/dL)，2B型vWD均值为8.6U/dL(1.6-19.7U/dL)，2M型vWD均值为3.9U/dL(1.0-6.8U/dL)，3型vWD均值为1.0U/dL(0.5-1.6U/dL)。
　　 (6)回归分析：用SZ-151-IgG和国外的抗GPIbα单抗2D4-IgG分别包板，所测vWF：RCof结果经直线回归分析得r=0.96。该方法与vWF抗原、胶原结合实验(vWD的另两项诊断实验)的相关性分别为r=0.91和r=0.85，可见有较好的相关性。
　　 结论：
　　 (1)获得1株新的抗GPIba mAb，可用于血浆vWF的瑞斯托霉素辅因子活性检测。
　　 (2)获得具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性的rfGPIbα H1-V289蛋白纯品。
　　 (3)建立了检测vWF：Rcof的ELISA方法，该方法敏感性好、特异性高、重复性好。
　　 (4)测定了36例正常人及25例vWD患者vWF：Rcof，结果与vWF抗原、胶原结合实验相符。
　　 (5)该方法可与其他几项方法组合用于vWD的确诊和分型，特别是对于2型vWD有重要的诊断价值。