三氧化二砷对转化生长-β1因子诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响

摘要

目的：
　　 肺间质纤维化是许多肺部疾病终末期共同的改变，死亡率高，并且缺乏有效治疗手段。其发病机制尚不清楚，目前主要认为在肺纤维化发病的起始阶段大量炎性细胞被活化并向肺内浸润，伴随着多种细胞因子的释放，形成连锁放大性质的瀑布效应，激活多种细胞，诱导肺组织内成纤维细胞的活化与增殖，并且分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，最终导致肺纤维化的形成。在这个病理过程中，转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)被认为是最重要的细胞因子，它可以诱导成纤维细胞向表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin.α-SMA)的肌成纤维细胞分化。而肺成纤维细胞胶原分泌增多造成。ECM异常沉积也被认为是肺纤维化的关键环节，其中Ⅰ、Ⅲ型胶原是主要成分，占ECM的绝大多数。减少肺成纤维细胞胶原的分泌，被认为可能是治疗肺纤维化的有效方式。我科前期研究发现三氧化二砷能够诱导早期博莱霉素致纤维化大鼠的肺组织中炎性细胞凋亡，并且降低肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸含量，减少肺组织中的胶原沉积，从而减轻肺纤维化进展。那么三氧化二砷的作用机理究竟如何?其减轻肺纤维化的作用是否通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖从而减少了胶原分泌?这些问题即是本课题研究的重点，拟通过探讨三氧化二砷对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖与Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响，阐明三氧化二砷治疗肺纤维化的部分作用机制。
　　 材料与方法：
　　 分离培养正常健康大鼠的肺组织的成纤维细胞，取自然纯化至第四代的细胞用于实验。采用TGF-β1对成纤维细胞进行诱导，之后分别予以不同浓度的三氧化二砷进行干预，观察干预后12h、24h、48h的成纤维细胞增殖情况，分别与对照组的细胞进行比较。用倒置显微镜观察细胞的形态和结构，MTT计数方法观察各组细胞的增殖情况，荧光定量PCR方法观察各组细胞α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达情况。
　　 结果：
　　 (1)原代离体培养的正常肺成纤维细胞在倒置显微镜下呈细长梭形，排列紧密、具有方向一致性，角蛋白免疫细胞化学染色显示为阴性，波形纤维蛋白免疫细胞化学染色显示为阳性，证实为成纤维细胞。(2)三氧化二砷可以抑制TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞的增殖；三氧化二砷1uM/L和2uM/L浓度组的细胞生长明显受抑制，细胞增殖抑制率最高达到50％以上(p<0.05)；肌成纤维细胞的标志物α-SMA的mRNA表达量也随之减少，最多可减少51.8％(p<0.05)。(3)三氧化二砷能够抑制TGF-β1诱导的肺肌成纤维细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原；三氧化二砷1uM/L组和三氧化二砷2uM/L组细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量明显减少，最多可减少50％以上(P<0.05)。三氧化二砷浓度、肌成纤维细胞的标志物α-SMA的mRNA表达量、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量之间呈现明显的量效关系。
　　 结论：
　　 三氧化二砷能够抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖；同时三氧化二砷能够减少TGF-β1诱导的肺肌成纤维细胞ECM中Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积，证实三氧化二砷能通过抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖，继之减少胶原分泌，从而起到减轻肺纤维化的作用。