钛合金关节假体采用氨气等离子注入法表面改性对成骨细胞生物活性影响的实验研究

摘要

第一部分
　　 目的：
　　 探讨氨气等离子浸没注入改性对钛金属假体表面含氮功能基团及其表征的影响。
　　 方法：
　　 使用等离子浸没注入法通过高能注入将氨气注入到钛金属的表面，制备具有含氮功能基团的表面，然后对该表层的物理形貌特征、化学组成，含量以及材料亲水性，表面能等进行测定。
　　 结果：
　　 测定显示在改性钛金属的表面可形成具有含氮功能基团的的表层，且含氮量明显增高；改性后的钛金属表面形貌没有明显改变；改性后钛金属表面其亲水性提高，表面能增加，具有显著性差异。
　　 结论：
　　 (1)等离子浸没注入法可以将氨气注入到钛金属表面，且不改变钛金属表面原有的物理形态；
　　 (2)注入后的关节假体表面的氮元素含量和亲水性均显著增高。笔者认为氨气等离子浸没注入方法的优点是，可避免传统人工关节假体所采用的涂层技术易导致涂层剥落的风险，因此有可能成为未来人工关节假体表面改性技术的一种新方法。
　　 第二部分
　　 目的：
　　 探讨氨气等离子注入改性对关节假体表层成骨细胞MC3T3-E1粘附及增殖活性的影响。
　　 方法：
　　 以纯钛作为对照组，以氨气改性钛作为实验组，使用直接接触法按一定的密度将MC3T3-E1细胞接种于钛金属表面。使用扫描电镜观察细胞接种12小时后，在各组材料表面细胞的伸展情况；使用MTT法检测接种6，18和24小时后所粘附细胞的数目；使用CCK-8法分别于接种后1,4和7天测定两组细胞的吸光值间接测定其活细胞数，使用吖啶橙染色法于接种后1,4，7天直接检测两组材料表面的活细胞数目。
　　 结果：
　　 在接种MC3T3-E1细胞后12小时后的扫描电镜结果显示，附着于对照组钛表面的细胞铺展状态与实验组细胞无显著差异；在接种MC3T3-E1细胞18、24小时后的MTT结果显示，附着于氨气等离子改性钛表面的细胞数较纯钛组显著增多，并有统计学意义(P＜0.05)；在接种MC3T3-EI细胞1,4．，7天后的CCK-8和吖啶橙染色检测结果表明，生长在实验组钛表面的活细胞数较对照组显著增多，并有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 人工关节假体表面采用氨气等离子浸没注入改性，能有效促进成骨细胞MC3T3-E1的粘附和晚期增殖。
　　 第三部分
　　 目的：
　　 探讨氨气等离子浸没注入改性对关节假体表层成骨细胞MC3T3-E1分化能力的影响。
　　 方法：
　　 以纯钛作为对照组，以氨气改性钛作为实验组，采用直接接触法分别接种MC3T3-E1细胞于两组钛片表面进行贴壁细胞培养。分别于1,4，7天三个时间点收集标本，检测碱性磷酸酶(ALP)活性；于3，6，9天三个时间点收集标本，RT-PCR法检测与成骨分化特异标志物碱性磷酸酶(ALP)，骨唾液酸蛋白(BSP)，骨钙素(OC)，Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的基因表达。
　　 结果：
　　 两组钛片ALP的活性随着时间的增加而增加，在细胞培养后第1天和第4天，氨气改性组ALP活性高于纯钛组，有统计学意义(P＜0.05)。两组钛片ALP基因的表达随着培养时间的增加也逐渐增加，在细胞培养后第3天和第6天，氨气改性组ALP基因表达高于纯钛组，有统计学意义(P＜0.05)。两组钛片COL-Ⅰ的表达随着时间的增加而大幅度升高，在细胞培养后的第6和9天，氨气等离子钛上细胞表达的COL-Ⅰ高于纯钛组，具有统计学差异(P＜0.05)。两组钛片BSP基因的表达出现先上升后下降的趋势，在细胞培养的第3，6和9天，两组钛片上成骨细胞表达的BSP均无统计学差异(P＞0.05)。两组钛片OC基因的表达出现先上升后下降的趋势，在细胞培养后的第6天，氨气等离子注入钛片组成骨细胞表达的OC高于纯钛组，具有统计学差异(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 经氨气等离子注入改性后的钛片对细胞晚期分化能力不产生影响。但能够促进成骨细胞MC3T3-E1的早期分化，以及促进成骨细胞分化中增殖期特定基因的表达。
　　 第四部分
　　 目的：
　　 探讨钛合金人工关节假体表面采用氨气等离子注入改性对成骨细胞Wnt信号通路表达的影响。
　　 方法：
　　 纯钛作为对照组，以氨气改性钛作为实验组，采用直接接触法将MC3T3-E1细胞接种到两组钛片表面进行培养。在细胞培养后的第1,4，7和15天收集标本，以RT-PCR法检测Wnt-1，β-catenin，LRP5，Frizzled-2和Runx2基因表达情况；于细胞培养后第1,4，12和24小时四个时间点收集标本，以定量RT-PCR法Tcf-1和DKK-1基因表达情况。
　　 结果：
　　 在细胞培养后的第1天到第7天，Wnt-1基因的表达呈上升趋势；在第1天和第4天，氨气等离子注入钛片上Wnt-1基因的表达水平高于纯钛组，差别具有统计学意义(p＜0.05)。在细胞培养整个阶段，两组钛片β-catenin和LRP5基因表达量逐渐增加，到第15天达到最高值。在第4，7和第15天时，氨气等离子注入钛片β-catenin和LRP5的基因表达量大于纯钛组，具有统计学意义(p＜0.05)。在细胞培养的第4和第7天，氨气等离子钛片表面细胞Fzd-2的表达高于纯钛组，具有统计学差异(p＜0.05)。在细胞培养后的第1天和第4天，氨气等离子注入钛片上细胞Runx2基因的表达水平高于纯钛组，具有统计学意义(p＜0.05)。在细胞培养后第1,4，12，和24小时，氨气等离子注入钛片上成骨细胞表达的Tcf-1和DKK-1基因同钛片组无统计学差异(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 氨气等离子注入改性主要通过Wnt信号通路调节钛表面成骨细胞的增殖和分化活动，由此构成对成骨细胞增殖活性的影响。笔者认为Wnt信号传导通道在氨气等离子注入钛促进成骨活性中起重要作用。