人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨细胞生物活性影响的实验研究

摘要

第一部分:人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜的制备及其表征检测
　　目的：试图采用磁过滤真空阴极弧沉积法在钛金属假体表面制备氧化锆膜，并检测其表征。方法：采用磁过滤真空阴极弧沉积法在纯钛片表面制备氧化锆膜，然后对氧化锆膜的形貌特征、化学组成、相组成等进行表征检测。结果：检测显示真空阴极弧沉积制备的氧化锆膜比较均匀、光滑、致密，具有纳米结构的表面。结论：采用磁过滤真空阴极弧沉积系统可在纯钛表面制备均匀、致密的氧化锆膜，制备的氧化锆膜具有纳米结构的表面，阴极弧沉积氧化锆膜的纳米表面结构可能与它的生物活性有关。
　　第二部分:人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞粘附及增殖活性的影响
　　目的：探讨阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞粘附及增殖活性的影响。方法：以阴极弧沉积ZrO2膜作为实验组，纯Ti作为对照组，分别按一定的密度接种MG63细胞进行培养。MTT法检测1、6、12、24小时两组材料表面附着的成骨细胞数；扫描电镜观察12和24小时成骨细胞在两组材料表面的铺展情况；鬼笔环肽荧光染色倒置荧光显微镜观察12和24小时两组材料表面细胞骨架蛋白的表达。CCK-8法检测1、4、7、10天时两组材料表面成骨细胞的增殖活性。结果：MTT结果显示：1小时后，两组样品表面MG63细胞附着的数量差异无统计学意义（P＞0.05）；6、12和24小时后，ZrO2膜表面的细胞数显著多于纯Ti表面，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。扫描电镜观察结果显示12和24小时后ZrO2组的细胞铺展优于Ti组，荧光显微镜观察结果显示12和24小时后ZrO2组表面细胞骨架蛋白的表达多于Ti组；CCK结果显示：培养4天及7天后，ZrO2膜表面的细胞增殖活性显著高于纯Ti表面，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：人工关节假体表面阴极弧沉积制备的氧化锆膜具有促进成骨细胞粘附及增殖的能力。
　　第三部分:人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞分化表型标志物的影响
　　目的：探讨阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞分化表型标志物的影响。方法：以阴极弧沉积ZrO2膜作为实验组，纯Ti作为对照组，分别按一定的密度接种MG63细胞进行培养。分别于第1、4、7、10天收集标本，检测碱性磷酸酶（ALP）活性；以定量RT-PCR法检测成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶、I型胶原（COLI）及骨钙素（OC）的基因表达情况；荧光染色倒置荧光显微镜观察4天时COLI蛋白的表达；ELISA检测1、4、7、10天时成骨细胞分泌OC蛋白量。结果：在培养第1天时，两组碱性磷酸酶活性及基因表达差异无统计学意义（p＞0.05）；随着培养时间的延长，两组碱性磷酸酶活性及基因表达均呈现出逐渐增加的趋势，第4、7、10天时，ZrO2组碱性磷酸酶活性及基因表达显著高于纯Ti组（p＜0.05）。第1天时，且两组COLI基因表达差异无统计学意义（p＞0.05）；在第4天及7天时，ZrO2组COLI基因表达显著高于纯Ti组（p＜0.05），在第10天时，两组COLI基因表达无统计学差异（p＞0.05）。在第1天和第4天培养时，两组OC基因表达无统计学差异（p＞0.05）；但在第7天和第10天时，ZrO2组的OC基因表达显著高于纯Ti组（p＜0.05）。第4天时，ZrO2组表面的COLI蛋白合成量多于Ti组。两组OC蛋白分泌量在第1、4天时无统计学差异（p＞0.05）；但在第7、10天时，ZrO2组OC蛋白分泌量均显著高于Ti组（p＜0.05）。结论：阴极弧沉积氧化锆膜具有提高MG63细胞分化表型标志物水平的能力，表明阴极弧沉积氧化锆膜是一种具有良好生物活性的涂层材料。
　　第四部分:人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨细胞破骨功能相关基因表达及蛋白分泌的影响
　　目的：探讨人工关节假体表面阴极弧沉积氧化锆膜对成骨细胞破骨细胞分化相关基因表达及蛋白分泌的影响。方法：以阴极弧沉积ZrO2膜作为实验组，纯Ti作为对照组，分别按一定的密度接种MG63细胞进行培养。分别于第1、4、7、10天收集标本，以定量RT-PCR法检测成骨细胞破骨细胞分化相关的骨保护素（OPG）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）基因表达情况；ELISA检测1、4、7、10天时成骨细胞分泌OPG和RANKL蛋白量。结果：第1天及第4天时，两组OPG基因表达无统计学差异（p＞0.05）；第7天及第10天时，ZrO2组OPG基因表达显著高于Ti组（p＜0.05）。第1天及第4天时，两组RANKL基因表达无显著差异（p＞0.05）；在第7天及第10天时，ZrO2组的基因表达显著低于Ti组（p＜0.05）。培养第1天及第4天时，两组样品表面的成骨细胞OPG蛋白分泌无统计学差异（p＞0.05）；第7天及第10天时， ZrO2组OPG蛋白分泌显著高于Ti组（p＜0.05）。第1天及第4天时，两组样品表面的成骨细胞RANKL蛋白分泌无显著差异（p＞0.05）；第7天及第10天时，ZrO2组的RANKL蛋白分泌显著低于Ti组（p＜0.05）。结论：人工关节假体表面阴极弧沉积氧化锆膜能够上调成骨细胞OPG水平，同时下调RANKL水平，提高OPG/RANKL相对比率，从而抑制破骨细胞的分化和活性。
　　第五部分:人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞活性影响的信号传导通道研究
　　目的：探讨人工关节假体表面阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞活性影响的可能信号传导通路。方法：以阴极弧沉积ZrO2膜作为实验组，纯Ti作为对照组，分别按照一定的密度在表面接种MG63细胞进行培养。分别于第6小时，24小时，4天，7天后四个时间点收集标本，检测整合素β1、FAK、ERK1、ERK2、c-fos及c-jun的基因表达。结果：6、24小时及4天后，ZrO2组整合素β1基因表达显著高于Ti组（p＜0.05）；7天后，两组整合素β1表达无统计学差异（p＞0.05）。6、24小时及4天后，ZrO2组FAK基因表达显著高于Ti组（p＜0.05）；7天后，两组FAK基因表达无统计学差异（p＞0.05）；6小时及24小时后，ZrO2组ERK1基因表达显著高于Ti组（p＜0.05）；4天及7天后，两组ERK1基因表达无显著差异（p＞0.05）。6、24小时及4天后，ZrO2组ERK2基因表达显著高于T组（p＜0.05）；7天后，两组样品表面的ERK2基因表达无显著差异（p＞0.05）。6、24小时、4天及7天后，ZrO2组c-fos基因表达显著高于Ti组（p＜0.05）。6、24小时及4天后，ZrO2组c-jun表达显著高于Ti组（p＜0.05）；7天后，两组样品表面的c-jun基因表达无统计学差异（p＞0.05）。结论：人工关节假体表面阴极弧沉积氧化锆膜可能通过整合素介导的MAPK/ERK信号传导途径影响细胞活性。

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封面

中文摘要

英文摘要

目录

前言

参考文献

第一部分 人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜制备及其表征检测

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞粘附及增殖活性的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞分化表型标志物的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨细胞破骨功能相关基因表达及蛋白分泌的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第五部分 人工关节假体阴极弧沉积氧化锆膜对成骨样MG63细胞信号传导通路影响的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

综述

参考文献

缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢