内源性硫化氢在脂多糖诱导肝细胞凋亡中的作用及其信号转导机制探讨

摘要

目的：探讨脂多糖（LPS）诱导大鼠肝细胞CBS-H2S、CSE-H2S体系的规律性变化；查明CBS、CSE分别及联合来源的H2S在LPS诱导肝细胞凋亡中的作用，探讨内源性H2S调节作用相关信号转导机制。
　　方法：大鼠肝细胞系BRL细胞培养，用CBS siRNA、CSE siRNA或CBS、CSE选择性抑制剂 AOAA、PAG单独或联合应用于正常培养的 BRL细胞、LPS处理的BRL细胞。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法检测CBS、CSE的基因和蛋白表达变化、蛋白定位，用去蛋白法检测细胞内源性H2S生成量变化；生化方法检测细胞上清LDH活性、细胞MDA含量、细胞GSH含量以及MTT细胞生长抑制率变化；用流式细胞术、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率变化；荧光显微镜检测线粒体膜电位（MMP）变化；Western blot检测细胞色素C（Cyt C）、caspase-3激活体蛋白表达变化。分别用CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG和PKCε、P44/42、STAT3特异性抑制剂（SCP0213、A6355、S31-201）交互作用的方法处理 LPS诱导BRL细胞凋亡，提取细胞不同组分蛋白质如细胞总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白，用Western blot检测LPS诱导BRL细胞凋亡过程中信号分子PKCε、P44/42、STAT3磷酸化修饰、PKCε活化后膜移位、STAT3活化后核移位。
　　结果：1、大鼠肝细胞系BRL细胞在静息条件下存在着CBS和CSE基因、蛋白表达以及内源性H2S生成，CBS、CSE蛋白阳性表达定位于细胞浆；CBS siRNA、CSE siRNA分别引起BRL细胞CBS、CSE蛋白表达下调，内源性H2S生成明显减少，细胞凋亡率明显增高，其中，相对于CBS siRNA引起BRL细胞H2S生成减少，CSE siRNA引起BRL细胞H2S生成减少更明显，CBS siRNA、CSE siRNA联合应用可进一步引起内源性H2S降低；与Negative control组比较，CBS siRNA、CSE siRNA单独或联合转染 BRL细胞4-24h，BRL细胞出现凋亡，而且凋亡率随时间变化而明显增加（P﹤0.05）。其中，CBS siRNA转染后，BRL细胞在4h、8h、12h、24h细胞凋亡率分别为12.80％、24.23%、27.67%和31.73%；CSE siRNA转让后，BRL细胞凋亡率在4-24h分别为17.27%、26.30%、32.33%和37.00%；当联合转染CBS siRNA与CSE siRNA后，BRL细胞凋亡率在4-24h分别为21.06%、30.40%、36.20%和42.40%。CBS siRNA、CSE siRNA分别或联合作用对BRL细胞上清LDH活性、细胞MDA含量、细胞GSH含量及MTT细胞增殖活力均无明显影响。2、CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG单独或联合作用BRL细胞，内源性H2S生成减少，细胞凋亡率上升， MMP明显降低，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调，其中，PAG引起内源性 H2S生成比 AOAA作用时生成量更少，细胞凋亡率明显上升，MMP下降，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调；AOAA、PAG可引起BRL细胞上清LDH活性增高，而细胞MDA含量、细胞GSH含量及MTT细胞生长抑制率无明显影响。3、LPS作用BRL细胞，随LPS作用时间延长（0~24h）及LPS作用浓度（0.1~100μg/ml）升高，CBS和CSE基因、蛋白表达明显上调，内源性H2S生成呈时间依赖性和剂量依赖性明显增多；细胞凋亡率上升，细胞MMP降低，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调；BRL细胞上清LDH活性增加，细胞MDA含量上升，细胞GSH含量在8h上调，12h、24h下降，MTT细胞生长抑制率在8h下调，12h、24h上升。4、CBS siRNA、CSE siRNA或AOAA、PAG单独或联合与LPS共同作用BRL细胞，与LPS单独作用组相比，BRL细胞凋亡率在4h上升，8h无显著性差异，12h、24h明显下降；细胞MMP在4h下降，8h无显著性差异，12h、24h明显上升；胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达在4h上升，8h无显著性差异，12h、24h明显下降。5、LPS作用BRL细胞，信号分子PKCε、P44/42、STAT3磷酸化蛋白表达上调，30min显著高于溶剂处理；其中，PKCε发生膜转位，STAT3发生核转位；AOAA、PAG单独或联合与 LPS共同作用 BRL细胞，与 LPS单独作用组相比，PKCε、P44/42、STAT3磷酸化蛋白表达（进一步明显）上调；与LPS单独作用组相比，PKCε、P44/42、STAT3特异性抑制剂（SCP0213、A6355、S31-201）分别与LPS共同作用BRL细胞，细胞凋亡率在4h、12h时间点明显上升；与CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG+LPS作用组相比，PKCε、P44/42、STAT3抑制剂（SCP0213、A6355、S31-201）与CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG和LPS共同作用BRL细胞，4h时间点细胞凋亡率未见明显变化，12h时间点细胞凋亡率明显上升；与LPS单独作用组相比，PKCε抑制剂（SCP0213）作用BRL细胞，P44/42、STAT3磷酸化蛋白表达下调；与LPS单独作用组相比，P44/42抑制剂（A6355）作用BRL细胞，PKCε磷酸化蛋白表达未见明显变化，STAT3磷酸化蛋白表达下调；与LPS作用组相比，STAT3抑制剂（S31-201）作用BRL细胞，PKCε、P44/42磷酸化蛋白表达均未见明显变化。
　　结论：1、大鼠肝细胞系BRL细胞在静息条件下存在着CBS和CSE基因、蛋白表达以及内源性H2S生成，其中CBS来源的H2S略少于CSE来源H2S；抑制内源性H2S生成可引起正常培养的BRL细胞凋亡；内源性H2S对LPS诱导肝细胞凋亡具有调节作用，少量生成增多H2S抑制细胞凋亡、多量生成的H2S促进细胞凋亡；2、细胞凋亡的线粒体途径参与介导了内源性 H2S对肝细胞凋亡的调节效应；信号分子PKCε、ERK1/2、STAT3参与介导内源性H2S对LPS引起肝细胞凋亡的调节作用，内源性H2S调控肝细胞凋亡的信号转导通路可能为PKCε—ERK1/2(P44/42)—STAT3。3、查明 LPS诱导肝细胞 CBS-H2S、CSE-H2S体系的规律性变化，初步揭示肝细胞CBS-H2S、CSE-H2S体系之间可能存在着的相互调节作用。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

序 言

参考文献

第一部分 抑制内源性硫化氢导致大鼠肝细胞凋亡

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

附 图

附 表

第二部分 内源性硫化氢对脂多糖引起大鼠肝细胞凋亡的调节作用

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

附 图

附 表

第三部分 内源性硫化氢调节脂多糖引起肝细胞凋亡的信号转导机制探讨

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

附 图

结 论

H2S在炎症中作用的研究进展

参考文献

硫化氢的信号转导机制研究进展

参考文献

个人简历

致谢