ZBTB蛋白家族成员-ZBTB9的生物学功能初探

摘要

ZBTB蛋白家族是一类含有C2H2Küppel锌指基序和BTB/POZ结构域的DNA结合蛋白，具有基因转录调节功能，在细胞增殖、分化、凋亡和功能调节等生物学过程中发挥着重要作用。本实验室根据数据库序列信息结合RT-PCR技术克隆到一个ZBTB家族成员ZBTB9(NM_152735.3)。目前，国内外还未见ZBTB9基因功能研究的相关报道，故本文对该基因信息展开了初步探索。
　　 生物信息学分析表明:ZBTB9定位于6p21.32;由2个外显子和1个内含子组成，外显子与内含子的交界符合GT-AG规则;含有1421bpORF，编码一个由473个氨基酸组成，分子量约为50.6KD的蛋白。SMART分析表明，ZBTB9蛋白N端含有1个BTB/POZ结构域，C端含有两个C2H2型锌指基序。借助生物学软件ClustalX对七种物种的ZBTB9蛋白进行同源性比对和进化树分析表明，ZBTB9蛋白与大鼠、小鼠、猩猩、猕猴、牛和非洲爪蟾六种物种的ZBTB9蛋白具有较高的同源性，且人ZBTB9基因与猩猩ZBTB9基因的分子进化距离最近，亲缘关系最为密切。
　　 通常蛋白质需转运到特定的亚细胞区域才能行使其生物学活性。我们通过构建GFP-ZBTB9及其截短的融合表达载体分析其亚细胞分布，结果表明:ZBTB9蛋白定位于细胞核且呈斑点状分布;缺失锌指基序的ZBTB9蛋白呈核周斑点状分布，而缺失BTB结构域的ZBTB9蛋白均匀分布于细胞核。由此可见，BTB结构域对ZBTB9蛋白的斑点状分布起关键作用。
　　 为了解ZBTB9蛋白的转录调控作用，我们利用一系列信号通路报告载体，通过双荧光素酶报告基因检测系统分析ZBTB9对相关信号通路的转录调控作用。结果表明，ZBTB9显著激活HSE的转录活性。后续我们构建了一系列ZBTB9截短表达载体，进一步分析ZBTB9不同功能区段的转录调控作用。结果表明:BTB结构域和锌指基序单独存在时均能发挥转录激活作用，且BTB结构域的转录激活作用与ZBTB9的激活作用相当;锌指基序的转录激活作用却比ZBTB9的激活作用强约100％。由此我们推测，ZBTB9可能在HSPs的转录调控及HSE信号通路中发挥激活作用，其中锌指基序发挥着重要作用，进而影响细胞的一系列生命活动。通常HSE信号通路的激活会促进各种恶性肿瘤细胞的增殖，故ZBTB9可能在肿瘤细胞的增殖中发挥功能。
　　 已有研究表明ZBTB家族成员大多数和肿瘤的发生发展有关。通过采用RT-PCR技术检测ZBTB9基因在宫颈癌细胞、肝癌细胞、胶质母细胞瘤细胞和胃癌细胞中的表达量，我们发现ZBTB9在肝癌细胞中有明显表达。为此，我们通过使用增殖诱导剂EGF和分化诱导剂ATRA干预SMMC-7721细胞，采用RT-PCR分析ZBTB9基因表达量的变化。RT-PCR检测结果显示，EGF可上调ZBTB9的表达，而ATRA却抑制ZBTB9的表达，这为进一步研究ZBTB9在肝癌发生中的功能奠定基础。

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第一章 引言

1 ZBTB蛋白家族的结构特征

1．1 N端的BTB/POZ结构域

1．2 C端C2H2型锌指基序

2．ZBTB蛋白家族的功能

2．1 ZBTB16(promyelocytic Leukemia Zinc finger protein-PLZF)—转录抑制因子

2．2 ZBTB17(又称为Miz-1，即Myc结合的锌指蛋白1(Myc-interacting zinc finger protein 1))-转录激活因子

第二章 ZBTB9基因的克隆及生物信息学分析

1．材料与试剂

1．1 菌株及质粒来源

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验所需试剂的配置

2．实验方法

2．1 基本实验方法

2．2 ZBTB9基因的克隆

2．3 ZBTB9基因及蛋白的生物信息学分析

3．实验结果和分析

3．1 RT-PCR扩增ZBTB9基因

3．2 ZBTB9基因结构分析

3．3 ZBTB9的可变剪切体分析

3．4 ZBTB9蛋白的结构域分析

3．5 ZBTB9的进化保守性分析及系统进化树的构建

4．讨论

第三章 ZBTB9亚细胞定位分析

1．材料与试剂

1．1 生物学软件与数据库

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验所需试剂的配置

2．实验方法

2．1 质粒的构建

2．2 ZBTB9蛋白及其截短与EGFP融合蛋白的表达

2．3 ZBTB9蛋白的亚细胞定位分析

3．实验结果和分析

3．1 pEGFP-ZBTB9重组质粒的构建与鉴定

3．2 ZBTB9蛋白及其截短与EGFP融合蛋白的表达

3．3 ZBTB9蛋白的亚细胞定位分析

4．讨论

第四章 ZBTB9在信号通路中的转录调控作用

1．材料与试剂

1．1 实验试剂

1．2 主要实验仪器

2．实验方法

2．1 ZBTB9全长及其截短与pcDNA3．1/myc-hisA(+)重组质粒的构建

2．2 ZBTB9蛋白及其截短与Myc融合蛋白的表达

2．3 双荧光素酶报告基因检测系统分析ZBTB9在信号通路中对不同元件的转录调控作用

2．4 ZBTB9激活HSE元件的剂量依赖性分析

2．5 定位ZBTB9蛋白对HSE元件发挥转录激活作用的主要作用部位

3．实验结果和分析

3．1 重组质粒的鉴定

3．2 ZBTB9蛋白及其截短与Myc重组蛋白的表达

3．3 ZBTB9对不同元件转录调控作用的分析

3．4 ZBTB9对HSE元件转录激活作用的剂量依赖性分析

3．5 ZBTB9蛋白对HSE元件发挥转录激活作用的主要作用部位分析

4．讨论

第五章 ZBTB9在增殖诱导剂EGF和分化诱导剂ATRA干预的肝癌细胞株SMMC-7721中表达量的变化

1．材料与试剂

1．1 细胞株及其来源

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验所需试剂的配置

2．实验方法

2．1 基本实验方法

2．2 RT-PCR扩增ZBTB9基因的相关区段

3．实验结果和分析

4．讨论

第六章 总结与展望

1．总结

2．展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

缩略词表

致谢