抗凋亡多肽Humanin通过抑制高脂血症状态下血小板的高反应性缓解动脉粥样硬化的发展

摘要

动脉粥样硬化是一种慢性炎症血管性疾病。当脂质斑块破裂后，形成动脉血栓会导致急性冠脉综合征、心肌梗死或者脑梗死等恶性临床事件，对人类的健康危害极大。但其发病机制目前仍不是十分清楚，寻找有效药物对该疾病的治疗一直是科研工作者的主要任务。
　　许多研究表明，血小板作为一类重要的血细胞，在多个方面参与了动脉粥样硬化的形成。尤其是在高脂血症状态下，血小板对内皮细胞的粘附性增强，并且激活的血小板会释放趋化因子和细胞因子促进炎症反应，招募和锚定单核/巨噬细胞和中性粒细胞等进入动脉粥样硬化病灶部位，促进炎症反应和动脉粥样硬化的发展。
　　抗凋亡多肽Humanin，首次报道它是从阿尔茨海默病(Alzheimer disease)病人脑中提取出来的一种由24个氨基酸所组成的多肽。最初发现Humanin能够对抗由阿尔茨海默病相关蛋白如淀粉样蛋白β所诱导的神经细胞凋亡。除了在神经系统中的作用外，近期研究表明Humanin在其他组织中也有表达并具有更广泛的作用。研究发现，在某些病理条件下如心肌缺血和脑缺血再灌注损伤中，Humanin能够起到保护心肌细胞和脑细胞的作用。另一项重要研究表明Humanin也参与了动脉粥样硬化的发生、发展，例如在人类血管内皮细胞和动脉粥样硬化患者颈动脉的脂质斑块中均发现有Humanin的表达。体外实验中证明Humanin能够缓解由氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)所诱导的血管内皮细胞功能障碍和细胞凋亡，但其具体作用机制仍不清楚，尤其是在与动脉粥样硬化密切相关的高血脂症状态下，Humanin是否能够影响高脂血症状态下的血小板高反应性和高血脂含量，以及最终是否能够影响动脉粥样硬化发展后期脂质斑块的形成？我们针对这些问题展开以下研究。
　　目的:
　　本文旨在探讨抗凋亡多肽Humanin是否能够影响高脂血症下血小板的高反应性，以及是否能够影响高脂血症下明显增高的血脂含量和体内动脉粥样硬化脂质斑块形成大小，最终影响动脉粥样硬化的发展。
　　在实验过程中，我们使用了Humanin的衍生物HNG，HNG多肽是Humanin在14位氨基酸由丝氨酸突变为甘氨酸，其抗凋亡活性比Humanin高1000多倍，更具有临床应用价值，而且HNG在其他病理研究中也被广泛采用，如心肌缺血和脑缺血再灌注小鼠模型中。
　　研究方法:
　　1.通过对低密度脂蛋白受体(LDLR)敲除小鼠（以下简写为LDLR-/-小鼠）喂食高脂饲料（high-fatdiet，以下简写为HFD），建立高脂血症及动脉粥样硬化小鼠模型。
　　2.在已建立好的高脂血症小鼠模型基础上，提取持续注射（0.5ug/天/只小鼠）与不注射HNG多肽的小鼠血小板进行比较，对比HNG多肽对高脂血症状态下血小板敏感性的影响。
　　3.通过眼眶后静脉丛抽取高脂血症小鼠的静脉血，分离出血浆后，比较持续注射（0.5ug/天/只小鼠）与不注射HNG多肽的小鼠血浆中的血脂含量，检测HNG多肽对高脂血症状态下小鼠血脂含量的影响。
　　4.当喂食HFD3～6个月后，LDLR-/-小鼠能够形成稳定的动脉粥样硬化斑块，我们在喂食HFD的同时持续注射HNG多肽（0.5ug/天/只小鼠），观察HNG是否能够影响LDLR-/-小鼠冠状及胸主动脉中脂质斑块的形成情况。
　　结果:
　　1.通过实验我们证明，LDLR-/-小鼠在喂食1～3个月HFD后，血脂含量较喂食普通饲料的野生型小鼠会有明显增高，当喂食3～6个月HFD后其冠状及胸主动脉中产生了脂质斑块形成，证明LDLR-/-小鼠喂食HFD确实能够建立高脂血症和动脉粥样硬化模型。
　　2.与未注射HNG多肽的高脂血症小鼠血小板相比，注射HNG多肽小鼠的血小板在ADP诱导血小板聚集反应中，其聚集率明显受到抑制，说明HNG多肽能够降低高脂血症下血小板的高反应性。
　　3.与未注射HNG多肽的高脂血症小鼠血脂含量比较，注射HNG多肽小鼠的血浆中，其血脂含量包括总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量均明显降低，说明HNG多肽能够对高脂血症状态下增高的血脂水平有一定的抑制作用。
　　4.与未注射HNG多肽的高脂血症小鼠所形成的动脉粥样硬化脂质斑块比较，注射HNG多肽后的小鼠冠状及胸主动脉内所形成的脂质斑块的面积明显减小。
　　结论:
　　我们阐明了HNG通过影响高脂血症状态下小鼠体内血小板的高反应性及血脂含量，进而影响到主动脉脂质斑块的形成，从而抑制了动脉粥样硬化的发展这一机制。该研究为进一步开发Humanin预防和治疗动脉粥样硬化疾病的潜力提供了理论基础。

目录

声明

摘要

引言

实验材料与方法

一、实验材料

1．耗材与试剂

2．主要试剂的配置

3．实验仪器

二、实验方法

1．动脉粥样硬化小鼠模型的建立及交配方法

2．LDLR基因敲除小鼠鉴定方法

3．实验分组

4．血小板的分离与制备

5．血小板聚集实验

6．血脂含量测定实验

7．剥离小鼠冠状及胸主动脉并进行主动脉斑块染色实验

8．统计学处理

结果

1．LDLR敲除小鼠基因型的鉴定

2．HNG降低高脂血症状态下血小板的高反应性

3．HNG降低高脂血症小鼠的血脂含量

4．HNG减小动脉粥样硬化脂质斑块的面积

分析讨论

结论

参考文献

综述 阿尔茨海默病与Humanin关系的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢