Cathepsin L新型抑制剂Clik148对大鼠局灶性缺血性脑损伤的保护作用及其抑制星形胶质细胞死亡的机制

摘要

目的：
　　 观察Cathepsin L新型抑制剂Clik148对大鼠局灶性缺血性脑损伤的保护作用及其保护缺血缺氧性星形胶质细胞损伤的机制：抑制Cathepsin L-Caspase信号机制的激活。
　　 方法：
　　 采用大鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)方法，建立脑缺血的大体模型。大鼠脑缺血前10min或缺血后6h侧脑室给予Clik148，以脑梗塞体积和行为学症状等指标以及Western blot法检测Clik148对缺血皮层MAP2蛋白表达水平的影响来评价Clik148对脑缺血性损伤的神经保护作用。采用原代培养大脑皮层星形胶质细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)方法，建立脑缺血的细胞模型。免疫荧光法和LDH法分别检测OGD诱导的星形胶质细胞GFAP阳性细胞数和乳酸脱氢酶漏出率；采用Westem Blot法和免疫组化法检测体内和体外缺血缺氧对星形胶质细胞Cathepsin L和凋亡相关蛋白的表达，以及Clik148对Cathepsin L和凋亡相关蛋白表达的影响。
　　 结果：
　　 在大鼠局灶性脑缺血体内模型中，Clik148(12.5、25、50nmol)可显著减小脑梗塞体积和改善行为学体征以及上调缺血皮层MAP2、GFAP蛋白的表达水平(P＜0.01)。在大鼠新生鼠的原代星形胶质细胞氧糖剥夺的体外缺血模型，LDH结果显示：Clik148(25、50、100μM)剂量依赖性地降低氧糖剥夺引起的星形胶质细胞LDH漏出率(P＜0．01)，可显著增加星形胶质细胞的细胞数目(P＜0.01)。Clik148对未进行氧糖剥夺处理的星形胶质细胞没有任何影响。Clik148同样能够上调星形胶质细胞中GFAP蛋白表达。在体内pMCAO大鼠诱导的缺血模型中，Western Blot结果显示：大鼠大脑缺血皮层活性Cathepsin L、tBid、Caspase-3上调以及线粒体的Cyt-c下调和细胞浆中Cyt-c上调。Clik148给药组可对抗大鼠局灶性脑缺血模型大鼠缺血皮层中活性Cathepsin L、tBid、Caspase-3的上调以及线粒体内的Cyt-c下调和细胞浆中Cyt-c上调。免疫组化结果显示：大鼠大脑缺血皮层星形胶质细胞中Cathepsin L从溶酶体释放到细胞质中以及Caspase-3阳性细胞增多；Clik148给药组可抑制大脑缺血皮层中Cathepsin L释放以及Caspase-3的阳性细胞数目。在OGD诱导的体外缺血模型中，Western Blot结果显示：星形胶质细胞在OGD后，活性Cathepsin L、tBid、Caspase-3上调以及线粒体的Cyt-c下调和细胞浆中Cyt-c上调。Westem Blot结果亦显示：Clik148可对抗OGD引起的星形胶质细胞中活性Cathepsin L、tBid、Caspase-3和Cyt-c蛋白表达的变化。
　　 结论：
　　 Cathepsin L新型抑制剂Clik148对大鼠局灶性脑缺血和OGD导致的星形胶质细胞损伤有显著保护作用，其作用机制可能与抑制Cathepsin L-Caspase信号通路的激活有关。