可溶性PD-L1在肺癌微环境中对T淋巴细胞功能影响及其在肺癌患者外周血中的表达特性

摘要

肺癌发病率和死亡率呈快速上升趋势，目前已成为临床最常见的恶性肿瘤之一，列居各种癌症死亡的首要原因。肿瘤细胞通过免疫逃逸使肿瘤免受宿主防御机制的杀伤，并不断进展。研究发现，协同刺激分子PD-L1(Programmeddeath-1ligand1，又命名为B7-H1)在包括肺癌的多种人肿瘤细胞系和实体肿瘤组织呈高表达并与肿瘤免疫逃逸相关。许多协同刺激分子如OX40、OX40L、CD40L和CTLA-4等除膜型外，还以可溶性的形式存在。临床研究显示，有些可溶性协同刺激分子的表达水平具有诊断或疾病预后判断的价值，患者肿瘤组织表达的PD-L1也可用于某些肿瘤临床疗效的参考指标。
　　 目前，因缺乏有效的检测方法，国内外对可溶性PD-L1（sPD-L1）的研究报道尚不多见。健康人机体内是否存在sPD-L1因子，该可溶性因子在肿瘤患者尤其是肺癌患者体内表达水平是否出现异常及其生物学意义尚无深入研究，值得进一步探讨。鉴此，本研究通过体外实验研究发现肺癌细胞表面表达膜型PD-L1并可以分泌可溶性PD-L1，两者均可通过PD-1/PD-L1抑制途径抑制T淋巴细胞增殖，发挥细胞免疫的负性调节作用；本研究中，我们应用苏州大学医学生物技术研究所自主研发的特异性人sPD-L1的ELISA体系对临床肺癌患者开展深入研究，检测临床肺癌患者sPD-L1分子的表达特性，分析其各项临床诊断指标的相关性，揭示该因子的表达水平与肺癌发生、发展的关系，探讨sPD-L1是否可以作为肺癌患者临床诊断、疗效预测和预后判断的依据，以PD-L1为作用靶点，为肺癌的临床治疗提供一种新的免疫干预手段。
　　 一、可溶性PD-L1在肺癌环境下通过PD-1/PD-L1抑制途径对T淋巴细胞功能的影响
　　 [目的]分析sPD-L1在肺癌细胞中的表达特性并探讨其通过PD-1/PD-L1抑制途径对人T淋巴细胞的生物学功能的影响。
　　 [方法]应用单克隆抗体标记和流式细胞术测肺癌细胞表面PD-L1分子和人外周血T细胞表面PD-1的表达特性，通过ELISA法检测肺癌细胞分泌的可溶sPD-L1的表达，应用CCK-8掺入法体外研究膜型和可溶性PD-L1对T细胞增殖的抑制作用。
　　 [结果]人外周血静止性T细胞低表达或不表达PD-1分子，而活化T细胞表面则上调表达PD-1分子；细胞表面组成性表达PD-L1分子的肺癌细胞株均能产生sPD-L1；表达PD-L1的肺癌细胞能通过PD-1/PD-L1信号抑制T淋巴细胞的增殖和活化(P＜0.05)；其培养上清对T淋巴细胞的增殖具有一定的抑制效应(P＜0.05)；特异性阻断该抑制信号在一定程度上可以恢复T淋巴细胞的增殖活性。
　　 [结论]肺癌细胞表面表达膜型PD-L1并可以分泌可溶性PD-L1，两者均可抑制T淋巴细胞增殖，发挥细胞免疫的负性调节作用，这可能使肿瘤抗原特异性T淋巴细胞不能及时活化并清除肿瘤细胞，导致肺癌细胞产生免疫逃逸。
　　 二、肺癌患者外周血可溶性PD-L1表达水平及其临床意义
　　 [目的]检测肺癌患者血清中可溶性程序性死亡配体-1(sPD-L1)的表达水平并探讨其临床意义。
　　 [方法]筛选2009年6月至2011年3月苏州大学附属第二医院呼吸科肺癌患者，共入选患者81例，其中男55例，女26例，年龄34～87岁，平均（65±6）岁。所有肺癌患者均为初诊且经组织或细胞病理学确诊；以88例性别、年龄匹配的健康体检者作为对照组，收集上述人群外周血清并记录肺癌患者的临床资料。采用Western-blot方法和酶联免疫吸附方法(ELISA)检测上述人员血清中sPD-L1的表达特性；免疫荧光标记和流式细胞术检测上述人群CD4+PD-1+T细胞、CD8+PD-1+T细胞及CD14+单核细胞PD-L1的变化。
　　 [结果]肺癌患者外周血存在sPD-L1分子的表达，其水平为(2.04±1.42)ng/ml，明显高于健康人外周血中该因子的含量(1.04士0.67)ng/ml，(P＜0.001)；肺癌患者血清中sPD-L1的异常高表达和淋巴结转移程度和有无远处转移密切相关。双色荧光标记标检测发现肺癌患者外周血T细胞亚群中CD4+PD-1+、CD8+PD-1+百分率(P＜0.05)均增高，同时，检测到单核细胞上PD-L1的表达水平也明显增加(P＜0.05)。连续采样检测治疗前后外周血CD4+T和CD8+T细胞上PD-1表达水平和CD14+单核细胞上PD-L1表达水平的动态变化，结果显示，疗效明显患者CD4+T和CD8+T细胞上PD-1和单核细胞上PD-L1水平虽仍较健康者偏高，但较肺癌患者平均水平明显减低，而疗效不显著甚至进展肺癌患者T淋巴细胞表面PD-1表达则较平均水平进一步升高(P＜0.05)。
　　 [结论]肺癌患者外周血清中sPD-L1的表达异常增高，且与肺癌的分期、转移和疗效有关，在个体化治疗中有助于肺癌患者的预后判断，可能成为重要的抗肿瘤靶点及分子标志物；肺癌患者外周血T细胞和单核细胞上也存在PD-1和PD-L1的异常表达，提示PD-1/PD-L1信号在T细胞与单核细胞相互作用过程中可能抑制T细胞增殖，从而导致肺癌细胞逃脱T细胞杀伤，参与疾病的发生发展。
　　 综上所述，本课题研究获得了以下研究结果：(1)组成性表达PD-L1分子的肺癌细胞株均能产生sPD-L1；在体外T细胞共培养体系中可以抑制T淋巴细胞的增殖，通过PD-L1阻断型单抗可以部分恢复T细胞增殖的能力。提示肺癌细胞表面的PD-L1系通过和激活的T细胞膜表面的PD-1结合而产生负性免疫调控作用。(2)利用自主研发的sPD-L1ELISA试剂盒，发现肺癌患者血清中存在sPD-L1高表达，且这种高表达和肺癌的分期和淋巴结转移有关，肺癌患者外周血T细胞和单核细胞上存在PD-1和PD-L1的异常表达，提示PD-1/PD-L1信号在T细胞与单核细胞相互作用过程中可能抑制T细胞增殖，从而导致肺癌细胞逃脱T细胞杀伤，参与疾病的发生发展。

目录

声明

前言

第一部分 可溶性PD-L1在肺癌环境下通过PD-1/PD-L1抑制途径对T淋巴细胞功能的影响

1.主要试剂与材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分 肺癌患者外周血可溶性PD-L1表达水平及其临床意义

1.主要试剂与材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

结论与展望

综述

缩写词表

攻读学位期间公开发表的论文

本课题获得的基金资助

致谢