Ph-骨髓增殖性肿瘤(MPN)JAK2V617F突变负荷量以及微颗粒研究

摘要

第一部分:JAK2V617F突变负荷量对Ph-MPN患者疾病影响的研究
　　背景与目的：骨髓增殖性肿瘤（MPN）是指骨髓组织持续增殖而致造血干细胞的克隆性增生，以红系、粒系或巨核细胞增生为主。现所说的MPN主要是指费城染色体阴性（Ph-）的真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）。大部分MPN患者含有JAK2V617F突变，且JAK2V617F突变负荷量影响MPN患者的临床表现，如白细胞计数、脾脏大小、血栓等。本实验的目旨在观察JAK2V617F突变量对患者的临床表现及生存影响。
　　方法：病例来源于2009.7～2011.12月期间在苏州大学附属第一医院就诊的MPN患者302例，采取患者的骨髓标本2ml，均使用肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，使用DNA抽提试剂盒抽提患者基因组DNA。利用等位基因特异性PCR方法扩增目的DNA，琼脂糖凝胶电泳筛选出176例JAK2V617F突变的标本，包括PV54例、ET116例、PMF6例。再通过实时定量PCR（RT-PCR）方法定量检测JAK2V617F突变负荷量，并通过测序方法检测PCR筛选的准确率。
　　结果：54例PV患者JAK2V617F突变负荷量明显高于116例ET患者（33.2%VS6.8%）（P<0.05），6例PMF患者JAK2V617F突变负荷量高于116例ET患者（43.1%VS6.8%）（P<0.05），而PV与PMF两组间突变负荷量差异无统计学意义（P>0.05）；PV组JAK2V617F突变负荷量>20%的患者比例高于ET组（68.5% VS26.7%）（P<0.05）；全组MPN患者血栓和非血栓组JAK2V617F突变负荷量之间无统计学差异，但就ET患者而言，伴血栓形成组的JAK2V617F突变负荷量高于未发生血栓组（11.1%VS3.8%）（P<0.05）；白细胞升高组(>10×109/L)患者JAK2V617F突变负荷量高于未升高组（P<0.05），血红蛋白浓度升高（>150g/L）及高龄（>60岁）患者JAK2V617F突变负荷量高于对照组（P<0.05），34例脾肿大患者基因突变负荷量高于56例脾脏未肿大组（P<0.05），然而JAK2V617F突变负荷量与血小板计数呈负相关（P<0.05）；性别与基因突变量之间无相关性（P>0.05）。经单因素分析JAK2V617F突变量对生存率无统计学影响，多因素分析白细胞计数、年龄、性别及脾肿大对生存率无影响（P>0.05）。
　　结论：PV及PMF患者JAK2V617F突变负荷量高于ET患者，而PV与PMF之间基因突变负荷量无明显差异；JAK2V617F突变负荷量影响MPN患者的临床表现：如白细胞数、血红蛋白浓度及脾脏大小，高龄（>60岁）患者JAK2V617F突变负荷量增加；伴血栓形成ET的患者，其JAK2V617F突变负荷量增高。
　　第二部分:Ph-MPN患者微颗粒测定及其与JAK2V617F突变关系的研究
　　背景与目的：微颗粒（MPs）是由细胞膜脱落形成，直径在0.1-0.8μm，已证实MPs在循环促凝中起重要作用，尤其是组织因子微颗粒（TF+MPs）。血小板微颗粒（PMPs）的促凝活性远高于血小板的止血能力，红细胞微颗粒（RMPs）具有极强的刺激凝血酶产生能力，在多种疾病中可激发血栓形成。内皮细胞微颗粒（EMPs）是内皮损伤的标志，激活内皮细胞，可诱导微颗粒的释放。MPN患者常伴发血栓出血表现，有报道显示ET患者血循环中MPs明显升高，TF+MPs水平与JAK2V617F突变有相关性。因此，本实验的目的是检测MPN患者血浆中的MPs水平状况，及其与JAK2V617F突变的关系。由于MPN患者常表现为红细胞及血小板升高，因此本实验共检测了四种MPs，分别为RMPs、PMPs、TF+MPs及EMPs。
　　方法：采用流式细胞术(FCM)检测微颗粒：抽取67例MPN患者空腹静脉血，包括PV12例、ET49例、PMF6例，枸橼酸钠抗凝(1:9)，以藻红蛋白标记特异性荧光抗体 CD235a（CD235a-PE）、CD61（CD61-PE）、CD142（CD142-PE）和 CD62E（CD62E-PE）分别标记红细胞、血小板、组织因子（TF）和内皮细胞，检测的MPs分别为RMPs、PMPs、TF+MPs及EMPs，0.8μm的标准微球设定前向检测区，界定直径大小在0-0.8μm之间，FCM检测这四种微颗粒的绝对计数。
　　结果：所检测的四种MPs水平均采用中位数（M）和四分位区间（IQR）表示。（1）实验组与正常对照组：67例MPN患者MPs水平均高于34例正常对照，RMPs49.0/μl（15.8-109.5/μl）：21.0/μl（13.8-32.6/μl）、PMPs181.2/μl（75.8-1111.6/μl）：74.9/μl（55.5-115.4/μl）、TF+MPs48.1/μl（13.1-72.4/μl）：31.0/μl（14.9-47.6/μl）、EMPs310.2/μl（128.6-1130.5/μl）：155.9/μl（100.3-227.6/μl）（P<0.05）；（2）MPN不同亚型间的MPs水平：PMF患者PMPs水平高于PV及ET患者（P<0.05），但在PV与ET患者之间无明显区别，同时另外三种MPs在三种亚型间无明显区别（P>0.05）；（3）MPs与JAK2V617F突变的关系：34例JAK2V617F突变组TF+MPs和RMPs明显高于未突变组，具体为56.0/μ（17.9-122.1/μL）：16.6/μl（11.6-47.3/μL）、65.6/μl（23.0-189.0/μL）：26.9/μl（11.7-74.4/μL）（P<0.05），另外两种MPs在两组间无明显区别（P>0.05）。（4）MPs在不同并发症中的水平：a.10例血栓组患者MPs水平高于31例非血栓组：RMPs78.7/μl（63.2-182.4/μl）：23.1/μl（11.2-76.1/μl）、PMPs569.9/μl（222.6-2275.0/μl）：111.8/μl（59.1-570.4/μl）、TF+MPs87.8/μl（58.5-129.0/μl）：16.4/μl（11.0-62.0/μl）、EMPs974.1/μl（206.4-1323.1/μl）：265.1/μl（102.6-513.0/μl）（P<0.05）；b.19例伴脾肿大组患者MPs高于14例非肿大组：RMPs91.5/μl（51.4-195.3/μl）：25.5/μl（16.7-74.4/μl）、PMPs774.8/μl（201.8-3069.1/μl）：174.8/μl（79.9-209.5/μl）、TF+MPs85.6/μl（45.7-156.6/μl）：14.1/μl（11.6-65.8/μl）、EMPs1174.5/μl（361.1-3491.2/μl）：307.6/μl（146.1-608.5/μl）（P<0.05）；
　　结论：所检测的四种MPs水平：MPN患者实验组高于正常对照组，血栓组高于非血栓组，脾肿大组高于非脾肿大组。JAK2V617F阳性组患者TF+MPs和RMPs高于对照未突变组，而另两种MPs水平在两组之间无明显区别。

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封面

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引 言

第一部分 JAK2V617F突变负荷量对Ph-MPN患者疾病影响的研究

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分 Ph-MPN患者微颗粒测定及其与JAK2V617F突变关系研究

病史与资料

结 果

讨 论

参考文献

综 述

英文缩写词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢