N糖基化修饰对B7-H3生物学功能影响的初步研究

摘要

目的：
　　蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，它参与并调控了许多关键的生命活动，且与许多疾病的发生有关，因此越来越受到广泛的重视。
　　B7-H3是共刺激分子家族中一个新成员，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。2IgB7-H3是B7-H3在人体内剪接体之一，其氨基酸序列上有4个N-糖基化修饰位点和1个O-糖基化修饰位点，ProtParam软件预测计算其分子量为33.7Kd,而实际分子量为55Kd，推测糖基化约占其分子量的38%，如此高度的糖基化修饰可能与B7-H3的功能有关。
　　B7-H3在很多肿瘤细胞中都有高表达，在不同肿瘤细胞中功能不尽相同，可能是一个肿瘤抗性的调控因子。B7-H3在胃癌细胞中有较高的阳性表达率，其表达与患者生存期、肿瘤浸润程度、组织类型相关。胃癌细胞中B7-H3能够促进β3GnT8和多聚乳糖胺糖链表达，生物信息学模拟B7-H3和β3GnT8蛋白三维结构中，发现二者能够空间对接。
　　本文基于已构建好的2IgB7-H3重组载体，利用快速定点突变方法构建去N-糖基化2IgB7-H3-mut真核表达载体，并将其稳定表达于人胃癌细胞SGC-7901中，初步观察B7-H3糖基化与否对细胞生物学功能的影响。
　　方法：
　　1.利用快速定点突变的方法，构建2IgB7-H3去N-糖基化突变表达载体pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-mut。
　　2.利用脂质体将空表达载体、正常及去N-糖基化的2IgB7-H3表达载体转染至人胃癌细胞SGC-7901中，经G418筛选获得2IgB7-H3去N-糖基化前、后的稳定表达细胞株SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/2IgB7-H3-mut以及空载体稳定表达细胞株SGC-7901/mock。
　　3.利用流式细胞术检测SGC-7901/2IgB7-H3-mut相对于SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/mock细胞周期的差异；利用MTT法检测SGC-7901/2IgB7-H3-mut相对于SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/mock细胞增殖能力的差异；利用划痕修复实验检测SGC-7901/2IgB7-H3-mut相对于SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/mock对细胞水平迁移能力的影响。
　　4.RT-PCR、Western Blot检测SGC-7901/2IgB7-H3-mut相对于SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/mockβ3GnT8表达的差异。
　　5.流式细胞术检测 SGC-7901/2IgB7-H3-mut相对于SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/mock对多聚乳糖胺糖链表达的影响。
　　结果：
　　1.限制性内切酶和DNA测序鉴定表明，成功构建人2IgB7-H3去N-糖基化真核表达载体pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-mut。
　　2.经G418筛选、RT-PCR和Western Blot鉴定，成功获得稳定表达2IgB7-H3-mut的细胞株SGC-7901/2IgB7-H3-mut。
　　3.与 SGC-7901/mock相比：SGC-7901/2IgB7-H3-mut和SGC-7901/2IgB7-H32IgB7-H3 mRNA表达量均明显升高(P＜0.001)，且SGC-7901/2IgB7-H3-mut与SGC-7901/2IgB7-H3相比差别无统计学意义(P＞0.05)；与SGC-7901/mock相比：SGC-7901/2IgB7-H3中2IgB7-H3蛋白表达量明显升高(P＜0.001)，而SGC-7901/2IgB7-H3-mut细胞中2IgB7-H3蛋白表达差异则无统计学意义(P＞0.05)，SGC-7901/2IgB7-H3-mut中2IgB7-H3蛋白表达量明显低于SGC-7901/2IgB7-H3(P＜0.001)。
　　4.SGC-7901/mock、SGC-7901/2IgB7-H3-mut和SGC-7901/2IgB7-H3的细胞周期和细胞的增殖能力均无明显差异。
　　5.与 SGC-7901/mock相比：SGC-7901/2IgB7-H3-mut和SGC-7901/2IgB7-H3细胞水平迁移能力均提高(P＜0.05)，SGC-7901/2IgB7-H3-mut比SGC-7901/2IgB7-H3水平迁移能力弱(P＜0.05)。
　　6.与 SGC-7901/mock相比：SGC-7901/2IgB7-H3-mut和SGC-7901/2IgB7-H3中β3GnT8和多聚乳糖胺的表达均明显增加(P＜0.05)，但SGC-7901/2IgB7-H3-mut与SGC-7901/2IgB7-H3相比差异则无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：
　　2IgB7-H3 N-糖基化修饰可能影响其抗原-抗体的识别；2IgB7-H3及其N-糖基化修饰对人胃癌 SGC-7901细胞增殖能力无明显关联；2IgB7-H3促进人胃癌SGC-7901细胞水平迁移的能力因其去N-糖基化而稍微减弱；2IgB7-H3促进人胃癌SGC-7901细胞中β3GnT8和多聚乳糖胺糖链表达的机制与其N-糖基化修饰无明显关联。

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引言

参考文献

第一部分 2IgB7-H3去糖基化突变载体的构建

1.材料与设备

2.方法

3结果

4.讨论

参考文献

第二部分 去糖基化B7-H3稳定转染SGC-7901细胞株的构建及其功能的研究

1.材料和设备

2方法

3结果

4.讨论

参考文献

小结与展望

本实验取得以下结果：

实验展望：

综述：基于PCR的定点突变技术的研究进展

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

本研究所获的基金资助

主要缩略词表

致谢