蛋白酶体抑制剂MG132对非小细胞肺癌生长、转移和放射敏感性的影响及机制的研究

摘要

目的:探讨蛋白酶体抑制剂 MG132联合 X射线对人非小细胞肺癌 A549和H1299细胞生长、转移侵袭、细胞凋亡和周期、放射敏感性的影响及机制如何，进一步构建人非小细胞肺癌的裸鼠移植瘤，在体内验证MG132的致放射增敏作用。
　　方法:（一）体外实验：1、MTT法检测不同MG132浓度不同预处理时间联合X射线下肺癌A549和H1299细胞的增殖变化；2、划痕实验和Transwell小室实验分别测定肺癌A549细胞和H1299细胞的迁移能力；3、Transwell小室实验检测肺癌A549和H1299细胞的侵袭能力；4、克隆形成法检测MG132对A549和H1299细胞的放射敏感性的影响；5、流式细胞术测定肺癌A549和H1299细胞的周期分布和细胞凋亡的影响；6、Western-blot法测定细胞蛋白表达水平的改变。（二）体内试验：建立25只裸鼠皮下人非小细胞肺癌移植瘤模型，将移植瘤模型裸鼠随机分为对照组、MG132组、照射组、照射+MG132组。测量每组移植瘤模型裸鼠的体重和肿瘤体积并绘制体重变化曲线和肿瘤生长曲线，同时计算各组的肿瘤生长抑制率。
　　结果:（一）体外实验结果：1.1、在无X射线照射下，MG132单独作用于人非小细胞肺癌A549和H1299细胞后表现出显著的细胞生长抑制作用，呈现剂量-效应和处理时间-效应关系，我们选择细胞存活90%以上时的MG132浓度（0.1μM）作为MG132实验剂量（non-toxic dose，无毒性剂量）用于后续实验的进行。1.2、在联合4GyX射线照射下，随着照前应用MG132预处理上述两种细胞的时间不断增加，两种细胞的存活率不断下降（P<0.01）。1.3、MG132预处理上述两种细胞6h后联合 X射线照射，随着照射剂量的增加，两种细胞的存活率不断下降（P<0.01）；2.1、MG132联合X射线可显著抑制人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的迁移能力。2.2、MG132联合 X射线可显著抑制人非小细胞肺癌 A549和H1299细胞的侵袭能力（P<0.05）；3.1、MG132预处理上述两种细胞6h后联合X射线照射，细胞的克隆存活率均随照射剂量的增加而减少（P<0.01）。―单击多靶模型‖显示，A549细胞单纯照射组和照射+MG132组的平均致死剂量（D0）分别为2.8和1.95Gy，准阈剂量Dq分别为1.91和1.7Gy，A549细胞的放射增敏比（SER）为1.44；H1299细胞单纯照射组和照射+MG132组的平均致死剂量（D0）分别为3.63和2.32Gy，准阈剂量Dq分别为4.44和2.67Gy，H1299细胞的放射增敏比（SER）为1.56。3.2、MG132联合X射线可显著增加人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的凋亡作用（P<0.01）。3.3、MG132联合X射线可显著增加A549细胞的G1期阻滞以及H1299细胞的G2期阻滞（P<0.05）；4、Western-blot结果显示，MG132联合X射线照射后能明显降低A549和H1299细胞的基质金属蛋白酶-2、-9，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，增加凋亡蛋白Bax的表达水平。同时，MG132联合X射线照射后还能显著增加A549细胞的G1期相关蛋白P53的表达，降低细胞周期蛋白cyclinD1的表达。并且降低H1299细胞的G2期相关蛋白wee1的表达。此外，细胞内NF-κB通路相关蛋白的表达水平也发生了变化，细胞NF-κB的抑制蛋白IκB磷酸化蛋白水平降低（IκB蛋白磷酸化后经泛素蛋白酶系统降解，而后 NF-κB活化），从而转位入胞核内的NF-κB蛋白水平降低。（二）体内实验结果：1、成功构建的 H1299细胞移植瘤裸鼠到终结实验而被处死前，裸鼠的体重无明显变化（P>0.05）；2、照射+MG132组的H1299细胞裸鼠移植瘤的体积与其它三组相比显著减小，差异具有统计学意义（P<0.05），MG132组、照射组、MG132+照射组的肿瘤生长抑制率分别为：19.58±4.94%、35.70±6.51%、65.25±7.47%。
　　结论:（1）MG132单独作用于人非小细胞肺癌A549和H1299细胞后即表现出显著的细胞生长抑制作用，呈现剂量-效应和处理时间-效应关系。其次，在联合X射线照射下，随着照前应用MG132预处理上述两种细胞的时间不断增加，MG132对两种细胞的生长抑制作用不断加强。此外，MG132预处理上述两种细胞6h后再行X射线照射，MG132对两种细胞的生长抑制作用亦随着照射剂量的增加而不断加强；（2）MG132联合X射线可显著抑制人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力；（3）MG132能明显增加人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的放射敏感性；（4）MG132可显著加强X线诱导的人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的凋亡作用，同时显著增加A549细胞的G1期阻滞以及H1299细胞的G2期阻滞；（5）MG132联合X射线照射通过降低A549和H1299细胞的基质金属蛋白酶-2、-9，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时增加凋亡蛋白Bax的表达，以达到其抑制细胞侵袭及增强辐射诱导凋亡的作用。此外，A549细胞经 MG132联合照射后，主要通过增加G1期相关蛋白P53的表达，降低细胞周期蛋白cyclinD1的表达，从而增加细胞的G1期阻滞。而H1299细胞经MG132联合照射后，则主要通过增加细胞内G2期相关蛋白wee1的表达从而增加细胞的G2/M期阻滞。此外，用MG132预处理细胞后能有效地阻碍IκB蛋白经泛素蛋白酶体系降解，进而阻碍辐射诱导的NF-κB活化，从而转位入胞核内的NF-κB蛋白降低，表明：抑制NF-κB活化很可能在MG132所致的细胞侵袭性降低，细胞凋亡和周期阻滞增加，以及放射敏感性增加中发挥着作用；（6）MG132联合X射线可对人非小细胞肺癌H1299细胞的裸鼠移植瘤的生长呈现显著的抑制作用，而对裸鼠的体重无明显影响。

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英文摘要

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参考文献

第一部分 MG132对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞抑制效应的研究

材料和方法

结果

讨论

第二部分 MG132联合X射线对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞转移和侵袭能力影响的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 MG132致人非小细胞肺癌A549和H1299细胞放射增敏作用的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 MG132对X射线照射后人非小细胞肺癌A549和H1299细胞中MMP-2、-9蛋白，Bcl-2/Bax蛋白，cyclinD1蛋白，P53蛋白，wee1蛋白，及NF-κB信号通路相关蛋白表达水平影响的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第五部分 人非小细胞肺癌H1299细胞裸鼠移植瘤模型建立

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第六部分 MG132对人非小细胞肺癌H1299细胞裸鼠移植瘤模型放射增敏作用的验证

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述

参考文献

发表论文及其它

致谢