GE11肽介导的靶向脂质体抗肿瘤作用及摄取机制的研究

摘要

目的：本文以A549细胞表面过度表达的EGFR为靶点，旨在制备新型多肽GE11修饰的阿霉素脂质体，考察GE11修饰脂质体的体外靶向效率、细胞毒性、摄取能力，对GE11修饰脂质体在肿瘤部位不同时间的分布进行体内评价，并研究GE11修饰脂质体的摄取机制，为非小细胞肺癌的靶向治疗提供实验依据。
　　方法：本研究通过加成反应合成DSPE-PEG2000-GE11，通过核磁共振氢谱（1H-NMR）和红外光谱（FITR）验证产物结构，采用高效液相色谱（HPLC）分析GE11与DSPE-PEG2000-Mal的连接率。利用薄膜分散-后插入法制备GE11修饰阿霉素脂质体（GE11-LP/DOX），并应用DLS、TEM和HPLC对脂质体的粒径、电位、形貌和包封率进行表征。通过MTT实验筛选脂质体表面连接GE11的最佳密度和测定脂质体的IC50值，采用荧光显微镜、流式细胞仪对脂质体的摄取分别进行定性和定量考察。采用近红外活体成像仪动态观察脂质体在肿瘤组织的聚集过程。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜分别考察脂质体的內吞机制和细胞内定位。
　　结果：1H-NMR和FTIR结果证实合成了DSPE-PEG2000-GE11，GE11与DSPE-PEG2000-Mal的连接率为90%。制备的不同GE11密度修饰的脂质体粒径在124nm左右，zeta电位在-10mv左右，TEM观察脂质体为类圆形囊泡，阿霉素的包封率大约为92%。靶头密度筛选表明脂质体表面的GE11密度与靶向效率有关，10%GE11修饰脂质体对A549细胞的靶向效率最高。GE11-LP/DOX的IC50值（1.29μg/mL）比对照组PEG-LP/DOX的IC50值（3.35μg/mL）低2.6倍。细胞摄取结果表明，在相同时间内，与PEG-LP/DOX相比GE11-LP/DOX更容易被摄取进入细胞。在一定时间内，两种脂质体逐渐向肿瘤组织聚集，而GE11-LP/DOX在肿瘤组织的荧光强度明显强于PEG-LP/DOX组。低温和能量耗竭降低了细胞对PEG-LP/DOX和GE11-LP/DOX的摄取，抑制剂氯丙嗪和秋水仙素对两种脂质体的摄取有抑制作用，共聚焦显微镜观察GE11-LP/DOX內吞进入细胞后与溶酶体融合。
　　结论：本研究合成了DSPE-PEG2000-GE11，通过后插入法制备了GE11-LP/DOX。体外细胞实验表明脂质体表面连接的GE11与EGFR识别并结合，促进细胞对脂质体的摄取，增强了脂质体对细胞的毒性；活体荧光成像实验表明GE11-LP/DOX聚集在裸鼠的肿瘤部位，并且主动靶向肿瘤组织。细胞摄取GE11-LP/DOX属于能量依赖型方式，抑制剂影响实验表明GE11-LP/DOX通过网格蛋白介导的內吞和巨胞饮作用进入细胞，然后转运至溶酶体。GE11-LP/DOX有望为靶向治疗非小细胞肺癌提供一种有前景的给药系统。

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第一章 前 言

1 非小细胞肺癌研究现状

2 脂质体的研究进展

3 纳米载体的细胞摄取机制

4 本课题研究背景及思路

第二章 膜材的合成及表征

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

第三章 GE11-LP/DOX的制备及表征

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

第四章 GE11-LP/DOX体内外评价及摄取机制研究

第一节 GE11-LP/DOX的体外评价

第二节 GE11-LP的体内评价

第三节 GE11-LP/DOX的细胞摄取机制研究

全文总结

课题特色

后续工作和展望

参考文献

攻读硕士学位期间公开发表的论文

致谢