动力蛋白功能改变通过自噬溶酶体途径影响α-突触核蛋白的清除

摘要

目的:
　　研究动力蛋白功能变化与α-突触核蛋白(α-synuclein)清除过程的关系,探讨相关动力蛋白参与此清除过程的可能机制。
　　方法:
　　以低分化PC12细胞为工具细胞,以经典的帕金森病致模毒素鱼藤酮和MPP+建立细胞模型。采用Western blot方法检测动力蛋白轻中间链(dynein light intermediate chain, DYNLIC)、动力蛋白中间链(dynein intermediate chain, DYNIC)、α-synuclein蛋白以及自噬标记蛋白的表达变化;利用siRNA干扰方法构建动力蛋白重链(dynein heavy chain, DYNHC)敲减的细胞模型;运用反转录PCR(reverse-transcription PCR, rt-PCR)方法检测α-synuclein的mRNA水平;以放线菌酮抑制新蛋白质合成后以western blot检测α-synuclein的蛋白表达变化以测定该蛋白的降解半衰期;使用透射电镜观察敲减DYNHC后细胞超微结构和自噬形态学改变;采用免疫荧光共染方法检测DYNHC敲减细胞内自噬相关蛋白LC3和溶酶体标记物lamp1共定位情况。连续30天向大鼠皮下注射鱼藤酮1.0 mg/kg诱导建立帕金森病大鼠模型,采用Western blot检测大鼠纹状体内动力蛋白、α-synuclein和LC3水平变化;在HEK293T细胞中使用质粒转染方法构建DYNIC过表达模型,检测该模型中α-synuclein表达和自噬水平变化,并通过共转染mRFP-GFP-LC3方法检测自噬体与溶酶体融合情况。
　　结果:
　　MPP+和鱼藤酮作用的PC12细胞中DYNIC、DYNLIC表达下降,α-synuclein含量升高;运用 siRNA干扰技术可成功抑制动力蛋白多种组成蛋白的表达;干扰DYNHC抑制动力蛋白表达可引起α-synuclein清除障碍和降解半衰期延长。在鱼藤酮诱导的PC12细胞和大鼠模型中可见DYNIC下降,同时伴随LC3-II和p62上升。动力蛋白敲减模型中LC3-II和p62水平上升,电镜可见自噬体增加,并且可观察到LC3和 lamp1失去共定位,这些提示存在自噬流完成障碍。DYNIC过表达后 HEK293T细胞LC3和p62蛋白水平下降,可逆转MPP+诱导的α-synuclein聚集,并且动力蛋白过表达能减轻MPP+诱导的自噬体-溶酶体融合障碍。
　　结论:
　　环境毒素诱导的细胞和动物帕金森模型中存在α-synuclein的水平升高,同时有动力蛋白表达下降;干扰动力蛋白功能可导致自噬流完成障碍,引起α-synuclein降解障碍。动力蛋白过表达可部分逆转 MPP+介导的α-synuclein聚集和自噬体-溶酶体融合障碍。这些结果表明,动力蛋白功能改变可能通过自噬溶酶体途径影响α-synuclein的清除。

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序言

材料和方法

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 实验仪器

1.3 溶液配制

2 实验方法

2.1 动物

2.2 细胞培养

2.3 瞬转siRNA干扰dynein序列及鉴定

2.4 放线菌酮抑制α-synuclein蛋白合成后蛋白降解半衰期检测

2.5 Western-blot 检测蛋白的表达

2.6 RT-PCR(Semi-Quantitative PCR)检测mRNA水平的表达

2.7 免疫荧光标记蛋白在激光共聚焦显微镜下的荧光表达情况

2.8 透射电镜检测细胞的形态结构

2.9 免疫荧光方法检测自噬

2.10 统计方法

结果

1、MPP+作用的PC12细胞中动力蛋白中间链（DYNIC）和轻中间链（DYNLIC）表达下降，α-synuclein含量升高

2、鱼藤酮作用后的 PC12 细胞中 DYNIC 和 DYNLIC 表达下降而 α-synuclein含量升高

3、DYNHC基因敲减可引起动力蛋白其他亚基表达降低

4、DYNHC基因敲减致α-synuclein蛋白水平增加而mRNA水平不变

5、DYNHC基因敲减致α-synuclein蛋白降解半衰期延长

6、鱼藤酮处理的PC12细胞和大鼠模型中存在自噬系统功能改变

7、DYNHC基因敲减的PC12细胞中LC3-II和p62蛋白水平上升, 自噬体增加

8、DYNHC基因敲减的PC12细胞中lamp1和LC3丧失共定位

9、动力蛋白过表达的HEK293T细胞中 LC3-II和 p62蛋白水平下降，并逆转MPP+诱导的α-synuclein聚集

10、HEK293T细胞过表达动力蛋白可逆转MPP+诱导的自噬体-溶酶体融合障碍

讨论

结论

参考文献

综述

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文及科研成果

致谢