TDP-43与β-淀粉样前体蛋白胞内结构域相互作用并诱导P53依赖的细胞凋亡

摘要

目的:
　　探求TDP-43(TAR DNA-binding protein43)与β-淀粉样前体蛋白胞内结构域(the intracellular domain of Amyloid Precursor Protein,AICD)之间的关系,从而揭示其在阿尔茨海默病病理机制中可能发挥的作用。
　　方法:
　　1.运用免疫荧光染色方法在HEK293/COS7细胞系上检测TDP-43与AICD在细胞水平的是否存在共定位。2.在细胞系上转染克隆质粒TDP-43-V5、APP-FLAG,48h后收集细胞提取蛋白,用免疫共沉淀(co-immunoprecipitations)的方法检测APP(β淀粉样蛋白前体蛋白)与 TDP-43在蛋白水平是否结合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大脑组织上用免疫共沉淀方法证明内源性的TDP-43与APP在正常小鼠脑组织中是否存在结合关系。进一步在细胞系上转染质粒TDP-43-V5、AICD-FLAG,以明确TDP-43是否与AICD存在结合关系。3.用双荧光素酶报告基因测试方法检测TDP-43对AICD是否存在转录作用,进一步加入APPγ酶切位点的分泌酶抑制剂,观察这种转录作用是否有变化。用Real-Time PCR的方法检测这种转录作用对P53 mRNA水平的影响。4.在分别转染了AICD,TDP-43, AICD+TDP-43的细胞系上计数Caspase-3阳性细胞,直接比较对细胞凋亡的作用。使用TUNEL法再次重复实验。
　　结果:
　　1.免疫荧光染色,观察到在体外培养的HEK293/COS7细胞系上,TDP-43在细胞水平定位于胞核,AICD大部分位于胞核,且二者存在共定位关系。2.在细胞系上转染质粒,进一步证明了TDP-43与AICD在蛋白水平存在结合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大脑组织上检测到内源性的TDP-43与AICD存在结合。3. TDP-43对AICD有类似于Fe65样的转录激活作用,但是这种作用可以被加入的APPγ酶切位点的分泌酶抑制剂所阻断(***p<0.001;NS:无意义)。TDP-43有类似与AICD的作用,增加P53 mRNA的表达水平,从而促进TP53基因编码的P53蛋白的转录作用,且TDP-43可以增强AICD该种转录激活作用(*:p<0.05;**:p<0.01;***p<0.001)。4. TDP-43在诱导细胞凋亡方面有与AICD类似的作用,其增加Caspase-3阳性或TUNEL阳性细胞数,促进细胞凋亡;并且TDP-43可以增强AICD诱导细胞凋亡的作用(*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001)。
　　结论:
　　TDP-43与AICD共定位存在与细胞核中;TDP-43增强AICD的转录作用,以及ACID对P53的转录调控作用;TDP-43促进AICD介导的细胞凋亡。因此,通过我们的研究结果可以设想,TDP-43可能为阿尔茨海默病研究的新靶点。阿尔茨海默病相关病理组织的萎缩可能与TDP-43调控的APP信号通路有相关性。

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研究背景

材料方法

一、相关实验仪器

二、相关实验试剂

三、实验相关质粒

四、实验相关细胞系

五、相关溶液配置

实验步骤

1.细胞系复苏

2.细胞系传代

3.细胞系转染

4.转化

5.摇菌

6.小量抽提质粒

7.Western-blot

8. 免疫共沉淀（co-immunoprecipitations）

9.细胞免疫荧光和共聚焦技术

10.荧光素酶报告基因系统检测转录活性

11.实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)技术检测mRNA的表达

12.TUNEL染色

13.统计方法

实验结果

1.TDP-43与AICD在细胞核内存在共定位。

2.TDP-43与AICD在蛋白水平上存在结合关系。

3.TDP-43对AICD存在转录激活作用。

4.TDP-43增强AICD诱导的细胞凋亡作用

参考文献

讨论

结论

综述

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢