过表达人LDH-C的CHO细胞株构建及其对乳酸代谢和细胞凋亡影响的研究

摘要

重组蛋白药物因为其具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点,已成为医药产品中的重要组成部分,现已广泛的应用于治疗各种疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤等。但是生产能力不足已经成为重组药物发展的瓶颈,为满足不断扩大的市场需要,重组蛋白质产量的增加不仅仅通过扩大反应器的体积来实现,更重要的是通过细胞工程技术改造获得一个细胞生长周期长,产量高,代谢废物少、抗凋亡的细胞株。在CHO细胞生长过程中,特别是在分批培养过程的后期,乳酸积累是限制细胞密度的重要原因之一,乳酸还会导致培养基pH下降,而在生物反应器中为调整pH值添加碱性物质还会导致渗透压升高,进而对细胞的生长产生不利的影响,最终导致细胞活率以及蛋白产量的降低。LDH-C基因存在于精子细胞、睾丸细胞和某些肿瘤中,作为乳酸脱氢酶(LDH)的一个亚型,同乳酸脱氢酶A和B相比,LDH-C更偏向于利用乳酸作为底物,催化乳酸向丙酮酸方向发生反应。LDH-C有助于精子在高乳酸的环境中生存,同时它允许乳酸作为细胞能量的来源。虽然LDH-C在CHO细胞中的作用目前还不清楚,但是LDH-C可以作为细胞工程上的一个有趣的靶点,它可能会使CHO细胞代谢向有氧乳酸代谢方向转变,改善细胞生长的高乳酸环境。因此我们猜想在CHO细胞中过表达LDH-C基因可能会对改善细胞培养的高乳酸环境从而抑制细胞凋亡。本研究旨在通过在CHO细胞中过表达人LDH-C基因,改善细胞培养后期的高乳酸环境,从而减少高乳酸引起的细胞凋亡。本研究的意义在于为减少代谢副产物乳酸提供新的途径,为提高抗体或重组蛋白类药物的产量奠定基础。
　　目的：在工程细胞CHO中过表达乳酸脱氢酶(LDH-C)基因,旨在利用基因工程手段构建出培养时间长、代谢副产物少、抗凋亡的细胞株,为抗体产量的增加奠定基础。
　　方法：运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人SKBR-3细胞中扩增出LDH-C基因,经双酶切(XhoⅠ和HindⅢ)后与真核表达载体pcDNA3.0相连接,利用Lipo2000转染至CHO细胞,经G418加压筛选获得稳定表达LDH-C的单克隆细胞株。经Real-time PCR检测LDH-C基因在mRNA水平的表达量,挑选出三株表达量比较高的细胞株进行补料分批培养,通过对比实验组细胞 CHO/LDH-C和对照组细胞CHO/pcDNA3.0的生长曲线、细胞活率以及IVCC曲线等参数,获得一株IVCC值最高的细胞。在三种不同的分批补料培养条件下,观察LDH-C对细胞生长的影响,每天记录细胞生长的密度,并用台盼蓝拒染法计算细胞的活率,同时每天检测细胞培养上清中代谢产物乳酸的含量,以研究LDH-C对CHO代谢的影响。对CHO/LDH-C进行细胞周期检测、Annexin V与PI双染检测细胞凋亡率、JC-1染色检测两组细胞的线粒体膜电位以及western-blot检测细胞凋亡通路中的相关蛋白表达,以研究LDH-C对凋亡的影响。
　　结果：⑴成功克隆人LDH-C基因,构建真核表达载体pcDNA3.0/LDH-C,并成功获得稳定转染的CHO/LDH-C细胞株。通过Real-timePCR鉴定、流加培养生长曲线以及酶活鉴定等实验获得一株LDH-C表达量较高,生长密度较高的6号克隆CHO/LDH-C＃6作为后续实验的研究对象。同时,选取CHO/pcDNA3.0＃4作为实验的对照组。⑵在初始培养条件下,两组细胞的生长无明显差别,但是在第三天分别加入40mM丙酮酸钠或者40mM乳酸钠后,对照组细胞的生长受到了抑制,而转染了LDH-C的实验组细胞生长密度显著高于对照组细胞,并且在这两种培养条件下实验组细胞的乳酸浓度明显低于对照组,特别是在流加培养的后期,LDH-C的作用更加显著,可以显著性降低乳酸浓度。⑶利用流式细胞仪检测细胞周期,结果显示转染后的CHO/LDH-C细胞S期增加,说明处于DNA复制期的细胞增多,增殖活性增加。流式检测细胞凋亡、western-blot以及线粒体膜电位检测均显示CHO/LDH-C细胞细胞凋亡降低,说明过表达LDH-C通过可以抑制CHO细胞的凋亡。
　　结论：本课题成功构建稳定表达人LDH-C基因的CHO/LDH-C细胞,并在补料分批培养中通过添加乳酸及丙酮酸钠模拟高乳酸环境,研究了此基因过表达对CHO细胞在高乳酸环境下存活的影响,并对高乳酸引起的凋亡进行了研究。研究表明,在未添加乳酸或丙酮酸钠的低乳酸环境下,LDH-C过表达未改善细胞生长及活率。而在乳酸及丙酮酸钠添加条件下,LDH-C过表达的CHO细胞具有更高的细胞密度和细胞活率,而且其乳酸浓度与对照组相比显著降低。此外, LDH-C过表达的细胞具有更快的增殖以及更强的抗凋亡能力。

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引言

参考文献

第一部分 稳定表达人LDH-C基因的CHO细胞株构建

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 LDH-C基因对CHO细胞生长以及乳酸代谢影响的研究

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分 LDH-C基因对CHO细胞抗凋亡能力影响的研究

材料与方法

实验结果

讨论

结论与展望

参考文献

综述

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