负性共刺激分子BTLA/HVEM在慢性乙肝患者外周血T细胞上的表达特性及其临床意义

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一种不直接引起细胞破坏的嗜肝性DNA病毒,是导致慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)、乙肝肝硬化、甚至是导致肝癌的主要原因之一。由HBV持续感染引起的CHB是世界性传染病,严重威胁着人类健康。机体中HBV特异性T细胞通过与HBV抗原多肽结合后对感染的肝细胞进行识别并予以杀灭,被认为是导致肝细胞损伤及病毒清除的主要机制。体内存在一定数量、活跃的、多特异性的CD4+和CD8+T细胞与HBV病毒的清除密切相关。研究发现慢性HBV感染的患者,其体内HBV特异性CD4+和CD8+T细胞数量及应答功能出现不足导致病毒清除无效,这种现象叫做 T细胞耗竭,它是病毒持续感染和肝脏炎症的主要因素。T细胞功能的正常发挥需要双信号的刺激,其接受的第一信号由抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)表达的MHC-抗原肽复合物和T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor,TCR)相互结合产生,而第二信号由共刺激分子的相互作用提供。而近年来发现,共刺激分子中除了有参与传递正性信号的正性共刺激分子,还有负性共刺激分子,对免疫细胞的适当活化与增殖发挥调节作用。研究发现耗竭T细胞表面异常性高表达负性共刺激分子,目前研究较多有:PD-1、CTLA-4和Tim-3分子等。B、T淋巴细胞衰减子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是2003年新发现的负性共刺激分子,其属于 CD28/B7超家族成员。配体为TNFR/TNF家族的成员单纯疱疹病毒侵入介质HVEM(herpesvirus entry mediator)。BTLA和配体 HVEM结合后,胞浆区的三个酪氨酸残基都可以磷酸化, ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)招募酪氨酸磷酸酶 SHP-1和SHP-2,并进一步介导传递抑制T细胞活化、增殖的负性信号。部分研究也初步揭示了BTLA/HVEM信号通路在T细胞耗竭中可能起到了重要的作用。本研究通过流式细胞术检测了慢性乙肝患者外周血中 T细胞上 BTLA和HVEM共刺激分子的表达特性,并分析了它们的表达水平与慢性乙肝相关的临床指标之间的相关性。探讨了BTLA/HVEM对HBV慢性感染的影响,从而初步揭示了负性共刺激分子在T细胞上的表达特性及其意义,为临床诊断提供有价值的指标。本研究分为两个部分：
　　第一部分：负性共刺激分子BTLA及其配体HVEM在慢性乙肝患者外周血T细胞上表达的检测与分析。
　　目的：采用免疫荧光标记和流式细胞术检测 CHB患者外周血 CD4+T和CD8+T细胞表面表达的BTLA和HVEM分子的表达水平,探讨BTLA/HVEM共刺激信号在CHB发病机制中可能的作用,进一步为有效治疗CHB提供理论依据。
　　方法：采用免疫荧光标记和流式细胞术检测了44例慢性乙肝患者和40例健康志愿者外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面BTLA和HVEM的表达。通过GraphPad Prism5.0软件分析、比较了健康组和慢性乙肝组之间BTLA和HVEM共刺激分子在CD4+T和CD8+T淋巴细胞上的表达水平变化情况。
　　结果：结果显示,与健康组相比,BTLA和HVEM在慢性乙肝组CD4+T细胞上表达明显出现了上调;而与健康组相比,慢性乙肝组中的CD8+BTLA+和CD8+HVEM+T细胞的比例则呈更为显著性上调。并且,CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面BTLA和HVEM分子的表达之间都表现出正相关性。
　　结论：慢性乙肝患者外周血T细胞上BTLA和HVEM分子都异常高表达,并且两者之间具有正的相关性,可能参与构成了T细胞耗竭的因素之一。
　　第二部分：BTLA/HVEM在慢性乙肝患者外周血T细胞上的表达与临床指标相关性的分析。
　　目的：通过分析CD4+T和CD8+T细胞上BTLA和HVEM分子的表达水平与慢性乙肝相关临床指标之间的相关性,从而探讨BTLA/HVEM负性分子在慢性乙肝的进展的可能临床意义,为慢性乙肝患者临床检测和干预提供有潜在价值的指标。
　　方法：乙型肝炎血清学标志,即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎 e抗原(HBeAg)、乙型肝炎 e抗体(HBeAb)及乙型肝炎核心抗体(HBcAb)的检测采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);采用荧光定量PCR法检测HBV DNA,检测结果以>5×102 copies/ml判断为阳性;肝功能的检测采用罗氏全自动生化分析仪。数据统计及相关性分析采用GraphPad Prism5.0软件。
　　结果：结果显示,慢性乙肝患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞上BTLA的表达水平与与ALT和AST的水平均呈显著正相关,而与HBV-DNA载量没有显著相关性。
　　结论：HBV-DNA载量对T细胞上BTLA/HVEM的表达水平没有影响,肝损伤指标ALT、AST的水平与CD4+T和CD8+T细胞上BTLA/HVEM的表达水平呈现出正相关。肝损伤指标 ALT、AST的水平能够反映肝脏损伤的程度,其水平越高肝脏的损伤程度也越严重。T细胞杀伤感染了HBV病毒的肝细胞可能是造成肝损伤的主要原因,T细胞上高表达的BTLA/HVEM能够导致T细胞免疫应答下调,从而达到保护肝脏免受过度的损伤,但同时这也导致HBV病毒在机体内的长期存在形成了长期慢性感染。综上所述,本研究初步证实了慢性乙肝患者外周血 CD4+T和 CD8+T细胞BTLA/HVEM表达的水平显著升高,并且发现它们的表达水平与肝损伤密切相关。提示BTLA和HVEM或许可作为新的临床免疫指标,有助于疾病的诊断及预后判断。BTLA/HVEM信号通路异常可能参与了CHB的免疫病理进程,其具体机制尚待于进一步研究。

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研究背景

1.慢性乙肝流行现状及危害

2.乙肝病毒感染中免疫细胞的应答特性

3.T细胞耗竭的特性及机制

4.负性共刺激分子与T细胞耗竭

5.T细胞耗竭与疾病

参考文献

第一部分 负性共刺激分子BTLA及其配体HVEM在慢性乙肝患者外周血T细胞上表达的检测与分析

1 材料与试剂

2方法

3 结果

参考文献

第二部分 BTLA/HVEM在慢性乙肝患者外周血T细胞上的表达与临床指标相关性的分析

1 材料与试剂

2方法

3 结果

参考文献

结论与展望

硕士期间发表的论文

本研究所获的基金资助

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