RIP1K通过激活自噬-溶酶体途径介导缺血性脑中风神经元necroptosis

摘要

目的:本实验室前期工作发现RIP1K特异性抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)及RIP1K基因沉默均可显著减少大鼠及小鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)诱导的脑梗塞体积,明显改善神经症状。本文进一步探讨RIP1K是否通过激活自噬-溶酶体信号途径参与缺血性脑中风诱导的神经元necroptosis。
　　方法:在体内,通过采用大、小鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)的方法,建立缺血性脑中风模型。透射电镜法观察缺血性脑中风诱导的神经元的形态学变化;侧脑室注射Nec-1及慢病毒观察对pMCAO处理的缺血皮层的影响。在体外,采用对原代大鼠皮层神经元氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)的方法,建立缺氧缺糖细胞模型。光镜法观察OGD诱导的神经元细胞形态学变化;LDH法检测OGD诱导的神经元乳酸脱氢酶漏出率;慢病毒转染法对培养第五天的神经元进行RIP1K基因沉默。Western blot法检测体内、体外缺血缺氧处理后的神经元RIP1K介导的自噬-溶酶体信号通路相关蛋白的表达,以及给予Nec-1或RIP1K基因沉默后对此通路相关蛋白表达的影响。
　　结果:透射电镜显示:pMCAO处理12h后,小鼠皮层神经元呈坏死样形态,给予Nec-1后,皮层神经元细胞坏死形态明显好转。在OGD诱导的神经元缺氧缺糖的细胞模型中,光镜结果显示:OGD处理后神经元坏死数显著增加,给予Nec-1(1,10,100μM)后可明显的改善细胞形态,增加细胞数目。LDH结果显示:OGD处理后,LDH漏出率显著增加(P<0.01),Nec-1(1,10,100μM)可显著的降低神经元乳酸脱氢酶漏出率(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示:在体内、体外,缺血性神经元中RIP1K蛋白表达量增加(P<0.01),MAP2蛋白表达量下降(P<0.01)。给予Nec-1及RIP1K基因沉默之后,均可显著的下调RIP1K蛋白的表达(P<0.01),上调MAP2蛋白的表达(P<0.01)。Western blot结果亦显示:在OGD诱导的神经元中,自噬-溶酶体通路相关蛋白LC3、Cathepsin B、Cathepsin L表达量上调(P<0.01), Nec-1及RIP1K基因沉默均可下调OGD诱导的神经元中LC3、Cathepsin B、Cathepsin L蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。
　　结论:
　　1. Nec-1及RIP1K基因沉默对pMCAO和OGD诱导的神经元损伤均具有显著的保护作用。
　　2. Nec-1及RIP1K基因沉默对缺血性脑中风诱导的神经元necroptosis的保护作用与抑制RIP1K激活的自噬-溶酶体信号通路有关。

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封面

中文摘要

英文摘要

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前言

第一部分 抑制RIP1K保护缺血性神经元损伤

第一节 抑制RIP1K保护pMCAO诱导的体内缺血性神经元损伤材料与方法

结果

小结

第二节 抑制RIP1K保护OGD诱导的体外缺血性神经元损伤材料与方法

结果

小结

第二部分 RIP1K介导的自噬-溶酶体信号通路参与

材料与方法

结果

小结

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

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