鸡miR-33对肝脏脂类代谢调控机理研究

摘要

MicroRNA(miRNA)是一类在基因后转录过程中通过对靶mRNA的翻译抑制和降解,而对基因表达起负调控作用的小的非编码RNA分子。其参与调控生物的生长、发育、细胞增殖、凋亡等多种生物学过程并与多种疾病密切相关。与哺乳动物不同,鸡的脂类从头合成主要是在肝脏而不是脂肪组织完成的,因此,其脂肪组织生长依赖于肝脏中合成的甘油三酯以及从肝脏中运输的量。而脂类代谢除了受固醇调节元件结合蛋白(SREBP)与肝X受体α(LXRα)这两个典型的转录因子调控外,还受到多种miRNA的调控。本研究以鸡miR-33为研究对象,对其进行了一系列的表达和功能研究,主要研究结果如下：
　　⑴miR-33的表达分析。通过生物信息分析方法发现鸡miR-33只存在一种类型,定位于鸡的1号染色体SREBP-2基因的内含子16上,是一个内含子型的miRNA。实时荧光定量PCR显示,miR-33在不同组织中均有表达,且在肌胃和心脏中的表达量较高,在其他组织中等表达。miR-33在肌胃中的表达量与脾脏、肾脏、脑、腺胃中的表达量差异显著(P<0.05),与肝脏和腿肌中的表达量差异极显著(P<0.01)。宿主基因SREBP-2基因在胸肌中的表达量最高,其次是脑、腿肌、肝脏组织,在肌胃中的表达量最低。鸡SREBP-2基因在胸肌中的表达量与其他各组织的表达量呈极显著差异(P<0.01)。miR-33与宿主基因SREBP-2的表达不存在组织特异性,并且两者在多种组织中不存在共表达现象。
　　⑵miR-33靶基因预测与验证。运用miRanda软件预测miR-33的靶基因,在鸡3'-UTR数据库的11891个基因中共预测到378个靶基因,其中筛选出的与脂肪酸代谢相关的候选靶基因CROT、CHPT1、HADHB、FTO、PRKAA1、PTDSS1和LRP2。体外双荧光素酶报告系统证实CROT、CHPT1、HADHB和FTO为miR-33的靶基因;靶位点突变实验证实CROT、CHPT1、HADHB和FTO基因3'-UTR上与 miR-33种子区互补位点为靶位点,且靶基因 CROT和 CHPT1的两个位点与miR-33种子区结合的程度不同,miR-33与CROT3'-UTR靶位点218-225结合能力较强,与CHPT13'-UTR靶位点846-865结合能力较强。
　　⑶miR-33与靶基因在鸡肝脏原代细胞中表达情况。为了研究在体外条件下, miR-33对脂类代谢的影响,以4周龄雌性商品代AA肉鸡为实验材料,采用改良的半原位两步灌流法并结合消化法分离肝细胞,进行原代培养,胶原酶消化法所获得的肝细胞分离良好,形态完整,铺板4h即贴壁;实时荧光定量PCR鸡肝脏原代细胞经培养2 d后,miR-33的表达量升高;而CROT、HADHB和FTO mRNA表达水平明显下降,且HADHB和FTO基因在培养2 d鸡肝脏原代细胞与刚分离的原代细胞中的表达量差异显著(P<0.05)。
　　⑷miR-33表达抑制或上升后对靶基因表达的影响。设计并合成LNA-antimiR-33转染鸡原代肝细胞,miR-33的表达水平下降了44％,而 miR-33靶基因CROT、CHPT1、HADHB和FTO的表达量都有一定程度的上升,其中CROT的表达量升高了近1.2倍,达到了显著水平(P<0.05);设计并合成miR-33模拟体使鸡肝细胞系miR-33过表达后,miR-33靶基因的表达量均在一定程度受抑制,其中CROT、HADHB的表达量极显著下降(P<0.01),FTO表达量显著下降(P<0.05)。
　　⑸miR-33和靶基因在不同发育时期肝脏中的表达情况。鸡miR-33在不同时期肝脏中的表达量呈先升高后下降再升高的趋势,靶基因除CHPT1外整体表达趋势与miR-33相反。经统计分析CROT(R=-0.695)、HADHB(R=-0.711)和FTO(R=-0.669) mRNA表达量miR-33呈中度负相关。
　　⑹综合以上研究结果,证实miR-33能通过与靶位点结合负调控靶基因CROT、HADHB、CHPT1和FTO的表达,初步发现miR-33通过调控与脂类代谢相关基因的表达,进而参与调控鸡的脂类代谢与脂肪沉积。

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第一部分 文献综述

1.1鸡肝脏代谢脂类代谢

1.2与脂类代谢相关的miRNA研究进展

1.3 本研究的目的及意义

1.4本项研究的思路、内容

第二部分 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 生物信息学分析

2.4 数据统计分析

第三部分 结果与分析

3.1 鸡miR-33序列分析

3.2鸡miR-33与宿主基因SREBP-2基因的表达模式

3.3鸡miR-33靶基因预测

3.4 miR-33与候选靶基因 3′UTR作用的结构学验证

3.5 miR-33与候选靶基因 3′UTR作用的功能学验证

3.6 miR-33与靶基因在不同时期肝脏中的表达情况

第四部分 讨论

4.1 miR-33与SREBP-2基因表达模式

4.2 miR-33靶基因预测

4.3 miR-33靶基因相互作用验证

4.4抑制或过表达miR-33对原代鸡肝细胞基因表达的影响

4.5 miR-33及靶基因在不同生长发育时期鸡肝脏中表达特征

4.6 展望

第五部分 结论

参考文献

附录

攻读学位期间本人出版或公开发表的论文

致谢