伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在动物体内外对细菌生物膜形成的影响

摘要

目的：研究伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在体内外对细菌生物膜(biofilm, BF)形成的影响,为预防和治疗BF相关性疾病及新型抗菌药物研发提供理论和实验依据。
　　方法：⑴实验菌株包括携带一长度为100 kb毒力质粒的鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar typhimurium, S.typhimurium)标准毒株χ3306、毒力质粒消除所得的S.typhimurium突变株χ3337、大肠埃希菌(Escherichia coli, E.coli)K12W1485和质粒pRST98经接合转移导入S.typhimuriumχ3337和E.coli K12W1485后分别形成的接合子χ3337/pRST98和E.coli K12W1485/pRST98。按照实验室既往实验已确定的BF形成的适宜温度和时间,将受试菌分别在96孔板和24孔板中30℃培养3 d后,结晶紫染色半定量法、扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)和共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)分析和比较受试菌BF形成的情况。⑵课题组前期研究发现伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在动物体内外可在一定程度上促进IL-10的产生。为探讨IL-10对细菌BF形成的影响,在鼠伤寒沙门菌培养液中分别加入浓度为1 ng/ml、10 ng/ml和100 ng/ml的IL-10,并设不加IL-10的对照组,30℃培养3 d,用上述方法分析BF形成的差异。⑶由于伤寒沙门菌具有严格的宿主专一性,只感染人,缺乏相应的动物模型。本部分选取了与伤寒沙门菌亲缘关系非常接近的鼠伤寒沙门菌作为研究对象,在动物体内研究了pRST98与BF形成的关系,为实时动态监测细菌在体内的播散情况,本实验室前期构建了将荧光素酶报告基因lux导入并整合到细菌染色体的生物发光菌。动物实验前首先分析了生物发光菌χ3337lux/pRST98、χ3337lux和不携带lux的χ3337/pRST98、χ3337的生长曲线及BF形成的差异。然后将6-8周BALB/c小鼠皮下注射结肠癌细胞 CT26建立荷瘤小鼠,尾静脉注射生物发光菌S.typhimuriumχ3337lux/pRST98和χ3337lux,用感染χ3337lux/pRST98的非荷瘤小鼠做对照组。多模式小动物活体成像系统(In-Vivo Imaging System, IVIS)下实时动态观察小鼠感染后1d、2d和3d受试菌在体内的播散情况;于感染的第3d解剖小鼠,收集肿瘤、肝脏和脾脏,SEM观察肿瘤表面BF的形成情况;观察脏器形态学变化;平板菌落计数法检测肿瘤、肝脏和脾脏的集落形成单位(colony-forming unit, CFU);将小鼠眼眶取血后,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清中IL-10的表达量。
　　结果：①pRST98对细菌生物膜形成的影响:结晶紫染色、SEM及CLSM观察, S.typhimuriumχ3337/pRST98和E.coli K12W1485/pRST98细菌聚集成团,构成三维立体结构的较厚的BF,而不携带该质粒的S.typhimuriumχ3306、χ3337和E.coli K12W1485呈零散状分布于视野中,不形成或较少形成BF;BF形成半定量结果显示,携带pRST98的S.typhimuriumχ3337/pRST98和E.coli K12W1485/pRST98的OD570值大于不携带该质粒的S.typhimuriumχ3306、χ3337和E.coli K12W1485,差异具有统计学意义(P<0.05);S.typhimuriumχ3306和χ3337的BF形成没有明显差异(P>0.05)。②pRST98在不同宿主菌中BF形成能力的差异:结晶紫染色半定量法显示E.coli K12W1485/pRST98形成BF能力明显低于S.typhimuriumχ3337/pRST98,OD570值有统计学差异(P<0.05);SEM和CLSM结果亦显示在S.typhimurium中pRST98对BF形成的促进作用强于在E.coli中的作用。③不同浓度IL-10对BF形成的影响:与不加IL-10相比,加入浓度为1 ng/ml的IL-10,细菌聚集成团,BF形成能力增加;IL-10浓度为10 ng/ml时,细菌大量聚集,产生非常明显的胞外基质,且形成的BF非常致密,半定量显示差异具有统计学意义(P<0.05);SEM观察发现,IL-10浓度为10 ng/ml时,细菌紧密排列,形成厚膜状物,产生大量胞外基质。而当浓度为100 ng/ml时,细菌聚集受到抑制,呈零散状分布于视野中,不形成或较少形成BF,半定量显示差异具有统计学意义(P<0.05)。不同浓度的IL-10对携带pRST98的鼠伤寒沙门菌BF形成的影响均强于未携带该质粒的菌株。④荧光素酶报告基因lux对细菌生长及BF形成的影响:S.typhimuriumχ3337、χ3337/pRST98与带有lux基因的生物发光菌χ3337lux、χ3337lux/pRST98细菌生长曲线无差异;结晶紫染色半定量法分析结果表明,在96孔板内30℃培养3 d的S.typhimuriumχ3337/pRST98与χ3337lux/pRST98,χ3337与χ3337lux两两之间OD570差异无统计学意义(P>0.05)。⑤IVIS观察发光菌在小鼠体内的播散:结果显示,经由尾静脉感染细菌的荷瘤小鼠在感染后第3 d发光菌聚集于荷瘤小鼠肿瘤部位,χ3337lux/pRST98发光强度明显高于χ3337lux。⑥肿瘤表面BF形成差异:SEM结果显示,χ3337lux/pRST98感染组的荷瘤小鼠,χ3337lux/pRST98聚集于肿瘤表面,产生胞外物质,而χ3337lux感染组细菌呈零散分布。⑦脏器形态学变化及活菌数:两感染组的荷瘤小鼠均出现肝脏和脾脏肿大,且表面有点状病灶,S.typhimuriumχ3337lux/pRST98感染组的脏器肿大和表面充血更严重。CFU计数表明,χ3337lux/pRST98感染组肿瘤、肝脏和脾脏的活菌数明显高于χ3337lux感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。在两感染组中,肿瘤的活菌数明显高于肝脏和脾脏。⑧IL-10表达差异:随感染时间延长,IL-10表达逐渐增加,且χ3337lux/pRST98组IL-10表达量明显高于χ3337lux组,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：⑴伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌中均能促进细菌BF形成,但在不同宿主菌中存在异质性,即在鼠伤寒沙门菌中对BF形成的促进作用强于在大肠埃希菌中的作用。⑵伤寒沙门菌接合性质粒pRST98可促进细菌在动物体内定殖并促进BF形成,加重感染。⑶伤寒沙门菌接合性质粒pRST98对细菌形成BF的影响与IL-10具有一定的相关性。

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引言

体外实验部分

（一）pRST98在不同宿主菌中对生物膜形成的影响

（二）不同浓度IL-10对生物膜形成的影响

体内实验部分

讨论

小结

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

本课题所获的基金资助

学术会议

英文缩略词表

致谢