家蚕转绿色荧光蛋白-蜘蛛丝蛋白融合基因的研究

摘要

为了改善蚕丝的机械性，本研究以piggyBac转座子载体为骨架，构建了含有家蚕丝素重链蛋白的N-端区域(NTD)-绿色荧光蛋白(eGFP)-蜘蛛丝蛋白[A2S8]28-重链蛋白的C-端区域(CTD)融合基因表达元件的打靶载体pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD，同时根据丝素重链基因内含子区域((AF226688:63011-63025和63052-63066)的DNA序列，设计组装了TALENs序列，构建了靶向丝素重链基因内含子区域的TALEN9-10载体；SURVEYOR和 lacZ中断法证实 TALEN9-10载体在家蚕卵母细胞株(BmN cells)中的效率约为13.95％。将TALEN9-10载体与打靶载体pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD混合，通过真空电穿孔技术，导入家蚕初产卵，筛选获得G0代转基因家蚕。PCR检测结果显示，G0代转基因家蚕蚕蛾基因组中有报告基因eGFP(e nha nce gree n fluo resce nce p rote in ge ne)的存在；Western Dot Blot检测转基因家蚕蚕茧蛋白样品，证实转基因家蚕表达了家蚕丝素重链蛋白的N-端区域(NTD)-绿色荧光蛋白(eGFP)-蜘蛛丝蛋白[A2S8]28Spider-重链蛋白的C-端区域(NTD)融合基因；ELISA定量检测显示，eGFP在转基因家蚕蚕茧蛋白可溶样品中的含量约为4%(摩尔比)，推测表达的蜘蛛丝蛋白Spider[A2S8]28在可溶样品中的摩尔比含量也为约4%。外源DNA在家蚕基因组的定位分析显示，外源DNA定位于家蚕基因组的23号染色体，打靶载体在转基因家蚕基因组中的整合方式为随机插入，并非由TALEN技术介导的定点插入；机械性能检测结果显示，G0代转基因家蚕蚕丝的最大极限拉力(Ma x.Stre ss)提高了约40-50%，最高的最大极限拉力约为700MPa,平均值约为620MPa。挑取G0代茧丝最大极限拉力(Ma x.Stres s)最高的转基因蚕杂交传代，得到G1代转蛛丝基因家蚕，检测结果显示，这种优良的机械性能特征能遗传至G1代转基因家蚕。研究结果为进一步通过改善蚕丝的机械性能提供了新线索。

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第一章 综述

1 转基因家蚕的研究

2 基因组编辑技术的发展及现状

参考文献

第二章 研究目的与研究内容

1 研究目的与意义

2 研究内容与技术路线

第三章 常用实验材料与方法

1 常用仪器

2. 常用的实验方法

第四章 TALENs质粒的构建及其效率在细胞中的检测

1 引言

2. 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

第五章 转蜘蛛丝蛋白基因的供体质粒pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的构建

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

参考文献

第六章 转基因家蚕的制作、筛选与鉴定

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

第七章 转基因家蚕蚕丝机械性能的检测

1 引言

2. 材料与方法

3. 结果与分析

4 讨论

参考文献

第八章 G1代转基因家蚕丝的机械性能研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

结论与创新点

资助项目

附录

附件一 TALENs (9-10)的相关DNA序列

附录二 pTAL3 载体DN A序列

附件三 pBR322-lacZ载体的DNA序列

附件四 TALENs (9-10)在靶定位点作用效率检测相关测序结果

附件五 pXL-BACⅡ-NTD-eGFP-Spider[A2S8]28-NTD载体序列

附件六 Piggybac染色体定位DNA序列测序结果

附件七 G1中的转基因家蚕茧丝机械性能数据汇总

致谢